背景与目的:动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是一个复杂的病理过程,其发病机制仍未完全清楚。研究表明Apelin/APJ系统与AS形成有密切关系,但Apelin/APJ系统在AS过程中的具体作用和机制仍不明确。Pannexin-1半通道-NLRP3途径在细胞增殖、迁移、炎症反应、氧化应激等过程中发挥着重要作用,参与了AS形成的过程。本研究旨在探讨Apelin-13是否通过Pannexin-1半通道-NLRP3途径介导血管平滑肌增殖、巨噬细胞炎症反应、血管内皮氧化应激、单核细胞-内皮细胞粘附,进而探讨Apelin-13是否对ApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的形成产生影响,及Pannexin-1半通道-NLRP3途径在此过程中的作用,为AS的治疗提供新的研究靶点。第一部分Pannexin-1半通道-NLRP3途径介导Apelin-13/APJ促人主动脉血管平滑肌细胞增殖目的:血管平滑肌细胞增殖与AS密切相关。本实验目的旨在研究Apelin-13对HA-VSMCs增殖的影响,以及在此过程中Pannexin-1半通道-NLRP3途径所发挥的作用。方法:1.采用MTT法、Brud分析法检测不同浓度Apelin-13对HA-VSMCs增殖的影响,以及Apelin-13刺激不同时间对HA-VSMCs增殖的影响。2.采用q RT-PCR法和Western Blot法,检测Apelin-13对HA-VSMCs中Pannexin-1 m RNA和蛋白表达的影响;免疫荧光法检测Apelin-13对HAVSMCs中Pannexin-1表达的影响;q RT-PCR法和Western Blot法检测Apelin-13刺激HA-VSMCs后,NLRP3m RNA和蛋白的表达;3.采用ATP生物荧光法检测不同浓度Apelin-13对HA-VSMCs中ATP释放的影响。4.应用Pannexin-1半通道的阻断剂Probenecid预处理后,Western Blot检测Apelin-13对HA-VSMCs中Pannexin-1、NLRP3蛋白表达的影响。5.应用Pannexin-1半通道的阻断剂Probenecid预处理后,ATP生物荧光检测Apelin-13对HA-VSMCs中ATP释放的影响,MTT法、Brud法检测Apelin-13对HA-VSMCs增殖的影响。6.应用si RNA-NLRP3转染,沉默NLRP3后,MTT法、Brud法检测Apelin-13对HA-VSMCs增殖的影响。结果:1.MTT法、Brud法检测结果显示,Apelin-13呈浓度（0-10μM）和时间（0-72h）依赖性促HA-VSMCs增殖。2.q RT-PCR法和Western Blot法检测结果显示,Apelin-13呈浓度依赖（0-10μM）性促进HA-VSMCs中Pannexin-1 m RNA和蛋白的表达。免疫荧光法检测结果显示,Apelin-13促进HA-VSMCs中Pannexin-1蛋白的表达。3.ATP生物荧光检测结果显示,Apelin-13呈浓度依赖（0-10μM）性促进HA-VSMCs中ATP释放。4.q RT-PCR法和Western Blot法检测结果显示,Apelin-13呈浓度依赖（0-10μM）性促进HA-VSMCs中NLRP3m RNA和蛋白的表达。5.应用Probenecid阻断Pannexin-1半通道后,能显著抑制Apelin-13促HA-VSMCs中Pannexin-1和NLRP3蛋白的表达。6.应用Probenecid阻断Pannexin-1半通道,能显著抑制Apelin-13促HA-VSMCs ATP释放的作用,抑制Apelin-13促HA-VSMCs增殖的作用。7.应用si RNA-NLRP3转染后,NLRP3蛋白表达下降,显著抑制Apelin-13促HA-VSMCs增殖的作用。小结:Apelin-13能促进HA-VSMCs增殖,Pannexin-1半通道-NLRP3途径参与了Apelin-13促HA-VSMCs增殖过程,阻断Pannexin-1半通道-NLRP3途径后,Apelin-13促HA-VSMCs增殖的作用受到明显抑制。第二部分Pannexin-1半通道-NLRP3途径介导Apelin-13/APJ促人源性巨噬细胞（THP-1）炎症反应目的:巨噬细胞浸润及其炎症因子释放引起的炎症反应在AS的发生发展过程中起到重要作用。本实验的目的旨在研究Apelin-13对人源性巨噬细胞（THP-1）炎症反应的影响,以及在此过程中Pannexin-1半通道-NLRP3途径所发挥的作用。方法:1.应用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测不同浓度Apelin-13刺激后,THP-1巨噬细胞IL-1β、IL-6、TNF-α分泌的水平。2.采用q RT-PCR法和Western Blot法,检测Apelin-13刺激THP-1巨噬细胞后,Pannexin-1m RNA和蛋白的表达;免疫荧光法检测Apelin-13对THP-1巨噬细胞中Pannexin-1表达的影响;q RT-PCR法和Western Blot法检测Apelin-13刺激THP-1巨噬细胞后,NLRP3 m RNA和蛋白的表达。3.采用ATP生物荧光检测不同浓度Apelin-13刺激后,THP-1巨噬细胞ATP释放的水平。4.应用Pannexin-1半通道的阻断剂Probenecid预处理THP-1巨噬细胞后,Western Blot法检测Apelin-13对THP-1中Pannexin-1、NLRP3蛋白表达的影响。5.应用Pannexin-1半通道的阻断剂Probenecid预处理THP-1巨噬细胞后,ELISA检测Apelin-13对IL-1β、IL-6、TNF-α分泌的影响,ATP生物荧光检测Apelin-13对THP-1巨噬细胞ATP释放的影响。6.应用si RNA-NLRP3转染,沉默NLRP3后,ELISA检测Apelin-13刺激THP-1巨噬细胞IL-1β、IL-6、TNF-α分泌的作用。结果:1.ELISA检测结果显示,Apelin-13呈浓度依赖（0-10μM）性刺激THP-1巨噬细胞IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌。2.q RT-PCR和Western Blot检测结果显示,Apelin-13呈浓度依赖（0-10μM）性促进THP-1巨噬细胞中Pannexin-1m RNA和蛋白的表达。免疫荧光法检测结果显示,Apelin-13促进THP-1巨噬细胞中Pannexin-1蛋白的表达。3.ATP生物荧光检测结果显示,Apelin-13呈浓度依赖（0-10μM）性刺激THP-1巨噬细胞ATP的释放。4.q RT-PCR和Western Blot检测结果显示,Apelin-13呈浓度依赖（0-10μM）性促进THP-1巨噬细胞中NLRP3 m RNA和蛋白的表达。5.应用Probenecid阻断Pannexin-1半通道,能显著抑制Apelin-13促THP-1巨噬细胞中Pannexin-1和NLRP3蛋白的表达。6.应用Probenecid阻断Pannexin-1半通道,能显著抑制Apelin-13促THP-1巨噬细胞ATP释放的作用,抑制Apelin-13促THP-1巨噬细胞IL-1β、IL-6、TNF-α分泌的作用。7.应用si RNA-NLRP3转染后,NLRP3蛋白表达下降,能显著抑制Apelin-13促THP-1巨噬细胞IL-1β、IL-6、TNF-α分泌的作用。小结:Apelin-13能促进THP-1巨噬细胞IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌,Pannexin-1半通道-NLRP3途径参与了这一过程。阻断Pannexin-1半通道-NLRP3途径后,Apelin-13促THP-1巨噬细胞炎症反应的作用明显受到抑制。促内皮细胞氧化应激以及单核细胞-内皮细胞粘附第三部分Pannexin-1半通道-NLRP3途径介导Apelin-13/APJ目的:内皮细胞氧化应激以及单核细胞-内皮细胞粘附在AS的过程中起到重要作用。本实验目的旨在研究Apelin-13对内皮细胞氧化应激以及单核细胞-内皮细胞粘附的影响,以及在此过程中Pannexin-1半通道-NLRP3途径所发挥的作用。方法:1.采用DCFH-DA探针标记,流式细胞术检测Apelin-13对人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）中ROS生成的影响。2.采用q RT-PCR法和Western Blot法,检测Apelin-13对HUVECs中Pannexin-1、NLRP3 m RNA和蛋白的表达。3.采用ATP生物荧光法检测不同浓度Apelin-13对HUVECs中ATP释放的影响。4.应用Pannexin-1半通道的阻断剂Probenecid预处理后,Western Blot检测Apelin-13对HUVECs中Pannexin-1和NLRP3蛋白表达的影响;用ATP生物荧光法检测Apelin-13对HUVECs中ATP释放的影响;流式细胞术检测Apelin-13对HUVECs中ROS水平的影响。5.应用si RNA-NLRP3转染,沉默NLRP3后,流式细胞术检测Apelin-13对HUVECs中ROS水平的影响。6.用Calcein AM标记单核细胞,多功能酶标仪检测Apelin-13刺激后单核细胞-HUVECs粘附的情况;应用Pannexin-1半通道的阻断剂Probenecid预处理后,检测Apelin-13刺激后单核细胞-HUVECs粘附的情况;应用si RNA-NLRP3转染,沉默NLRP3后,检测Apelin-13刺激后单核细胞-HUVECs粘附的情况。结果:1.流式细胞术检测结果显示,Apelin-13呈浓度依赖（0-10μM）性和时间依赖（0-72h）性促进HUVECs中ROS生成。2.q RT-PCR和Western Blot检测结果显示,Apelin-13呈浓度依赖（0-10μM）性促进HUVECs中Pannexin-1 m RNA和蛋白的表达。3.ATP生物荧光检测结果显示,Apelin-13呈浓度依赖（0-10μM）性促进HUVECs中ATP的释放。4.q RT-PCR和Western Blot检测结果显示,Apelin-13呈浓度依赖（0-10μM）性促进HUVECs中NLRP3 m RNA和蛋白的表达;5.应用Probenecid阻断Pannexin-1半通道后,能显著抑制Apelin-13促HUVECs中Pannexin-1和NLRP3蛋白的表达,抑制Apelin-13促HUVECs中ROS生成以及ATP释放的作用。6.应用si RNA-NLRP3转染后,NLRP3蛋白表达下降,显著抑制Apelin-13促HUVECs中ROS生成的作用。7.用Calcein AM标记单核细胞,多功能酶标仪检测结果显示,Apelin-13能显著促进单核细胞-HUVECs的粘附;Probenecid能显著抑制Apelin-13促单核细胞-HUVECs粘附的作用;应用si RNA-NLRP3转染,沉默NLRP3表达后,能显著抑制Apelin-13诱导单核细胞-HUVECs的粘附。Apelin-13能促进HUVECs中ROS的生成,促进单核细胞-HUVECs的粘附,Pannexin-1半通道-NLRP3途径参与了这一过程。阻断Pannexin-1半通道-NLRP3途径后,Apelin-13促HUVECs中ROS生成和促进单核细胞-HUVECs粘附的作用均受到抑制。小结:第四部分Pannexin-1半通道-NLRP3途径参与Apelin-13/APJ促ApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化目的:采用高脂高胆固醇饮食喂养诱导ApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化（AS）形成,观察不同浓度Apelin-13对ApoE^-/-小鼠AS形成的影响,进一步探讨Pannexin-1半通道-NLRP3途径是否参与Apelin-13促ApoE^-/-小鼠AS。方法:1.实验动物造模和分组:雄性ApoE^-/-小鼠作为研究对象,随机分为3组:模型组、低剂量Apelin-13处理组（1 mg/kg）、高剂量Apelin-13处理组（5 mg/kg）。2.将各组小鼠主动脉根部的石蜡切片用Movat染色法染色,在显微镜下观察组织切片并拍照,计算各组小鼠AS斑块的面积;3.对各组小鼠主动脉弓分支和主动脉根部的石蜡切片进行VerhoeffVan Gieson染色,在显微镜下观察斑块的着色,计算各组AS斑块的破裂率和破裂面积。4.用免疫组化法检测ApoE^-/-小鼠主动脉AS斑块中α-SMC-actin、MAC-3含量的变化。5.天狼星红染色检测主动脉AS斑块中胶原纤维的含量。6.用Western blot检测ApoE^-/-小鼠主动脉中Pannexin-1、NLRP3蛋白的表达。结果:1.Movat染色结果显示,Apelin-13能促进ApoE^-/-小鼠主动脉AS的形成。高剂量Apelin-13组小鼠AS损伤面积明显大于模型组小鼠AS损伤面积（P<0.05）。2.Verhoeff-Van Gieson染色结果显示,高剂量Apelin-13组ApoE^-/-小鼠主动脉根部的斑块破裂率和平均破裂面积较低剂量组、模型组明显增加（P<0.05）,但对小鼠主动脉弓分支的破裂率和平均破裂面积均未见显著性影响。3.免疫组化检测结果显示,各组小鼠AS斑块中α-actin的表达水平没有显著性差异。高剂量Apelin-13组中MAC-3阳性反应面积占斑块总面积明显增加,与模型组和低剂量Apelin-13组相比有显著性增加（P<0.05）。提示高剂量外源性Apelin-13可以显著促进巨噬细胞浸润,加重小鼠AS斑块的形成。4.天狼星红染色结果显示各组小鼠主动脉动脉粥样斑块内胶原成分没有显著性差异。5.Western blot检测结果显示,Apelin-13显著增加ApoE^-/-小鼠主动脉中Pannexin-1和NLRP3蛋白的表达。小结:Apelin-13能促进ApoE^-/-小鼠AS的发展,使AS斑块中巨噬细胞浸润显著增加,Pannexin-1半通道-NLRP3途径可能参与了这一过程。总结论:Pannexin-1半通道-NLRP3途径能够介导Apelin-13/APJ促进HAVSMCs、THP-1巨噬细胞炎症反应、HUVECs氧化应激和单核内皮细胞粘附。Pannexin-1半通道-NLRP3途径可能参与Apelin-13/APJ促ApoE^-/-小鼠AS的形成。