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目的:非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是全世界主要的健康问题。但是,目前尚无有效的针对NAFLD的治疗方法。深入的研究表明,表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)是一种从绿茶中提取的主要的生物活性物质,在治疗NAFLD中显示出了有益的功效。然而EGCG改善该病的具体分子机制尚未清楚,本研究主要探讨EGCG改善NAFLD可能的作用靶点。研究方法:1.筛选EGCG可能的靶蛋白:使用蛋白质数据库Protein Data Bank的配体搜索功能,将EGCG的化学结构输入并搜索与之共结晶的蛋白。为进一步扩大EGCG靶蛋白的搜索范围,将EGCG的黄酮母核作为子结构于该数据库中进行子结构搜索。搜索得到含有黄酮结构的配体,与这些配体共结晶的蛋白很可能能够与EGCG结合。将得到的蛋白名字和非酒精性脂肪性肝病作为关键词在Pubmed数据库中进行检索,得到和NAFLD相关的蛋白。2.分子对接:使用分子对接软件Glide对EGCG和可能的靶蛋白进行分子对接,探索二者之间的亲和力和作用方式。3.分子动力学模拟:使用分子动力学模拟软件Desmond对二者进行100ns的动力学模拟,进一步探讨二者的结合方式和稳定性。4.酶活性测定:选用DPP4抑制剂西格列汀为阳性对照,使用DPPIV-Glo?Protease kit试剂盒来测定EGCG等茶多酚对DPP4酶活性的影响。5.细胞实验验证:培养人肝癌HepG2细胞系,使用油酸诱导NAFLD细胞模型,再用EGCG进行干预,分为三组:对照组(NC),油酸组(OA),油酸+EGCG组(OA+EGCG)。干预72h后进行油红O染色观察细胞内脂滴情况,甘油三酯试剂盒测定细胞内甘油三酯含量,实时荧光聚合酶链式反应(Real-Time PCR)测量各组的DPP4表达水平。结果:1.靶蛋白筛选结果:将EGCG直接作为配体搜索得出5种与EGCG结合的靶蛋白,在Pubmed数据库检索均与NAFLD无关。扩大范围的子结构搜索得到17个化合物含有黄酮母核,这17个化合物共和40种蛋白共结晶,这些蛋白经过筛查后只有二肽基肽酶4(DPP4,PDB ID:5J3J)是NAFLD相关蛋白。2.分子对接:分子对接结果表明氢键是EGCG和DPP4结合的主要作用力,关键氨基酸残基Glu205、Glu206、Pro550、Cys551、Arg669和EGCG形成了氢键,此外还有π–π和π–阳离子作用形成。3.分子动力学模拟:模拟结果显示DPP4蛋白主链的RMSD值从1.2?增加并逐渐稳定至2.6?,这意味着蛋白质在100ns的模拟过程中没有显示出大的波动,系统逐渐平衡。EGCG在整个100ns的动力学模拟过程中与残基Glu206一直存在结合作用,其它与EGCG有着显著相互作用的残基是Val207,Phe357,Pro550,Tyr662,Asp663,Tyr666和Tyr670。当系统稳定时,分析了DPP4-EGCG复合物相互作用的稳定性,氢键和疏水作用在EGCG和DPP4的结合中起着重要作用。4.酶活性测定:通过使用DPPIVGlo?Protease kit测定EGCG和其他四种茶多酚(儿茶素,表儿茶素,表儿茶素没食子酸酯,表没食子儿茶素)对DPP4酶活性的影响,使用GraphPad Prism8中的非线性回归方程拟合得到IC50值,结果表明EGCG对DPP4酶的抑制性最强,其半抑制浓度IC50为28.42μM。5.细胞实验验证:油红O染色结果显示,与NC组比,OA组脂质红染更为明显,EGCG干预后改善了OA诱导的HepG2细胞中的脂质沉积,甘油三酯含量与油红O染色结果一致。PCR结果表明,OA诱导后,OA组的DPP4表达较NC组升高。EGCG干预后,与OA组相比,OA+EGCG组中DPP4表达降低,这些结果表明EGCG降低了NAFLD细胞模型中的脂质沉积和DPP4表达。结论:1.分子模拟结果显示EGCG通过氢键作用和疏水作用,与DPP4蛋白活性位点中的关键氨基酸残基Glu205、Glu206、Pro550、Phe357和Tyr666等结合。2.EGCG可抑制DPP4的酶活性,减少NAFLD细胞模型中DPP4的表达。