【摘 要】
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第一章人脂联素基因的克隆和真核表达目的:克隆人脂联素基因( apM1 ),构建真核表达载体pCDEF-apM1,检测其在HEK293细胞中的表达水平,为脂联素基因重组腺病毒的构建和表达提供
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第一章人脂联素基因的克隆和真核表达目的:克隆人脂联素基因( apM1 ),构建真核表达载体pCDEF-apM1,检测其在HEK293细胞中的表达水平,为脂联素基因重组腺病毒的构建和表达提供实验基础;并构建球状脂联素(gAdiponectin)基因的真核表达载体,检测其在人脐静脉内皮细胞株HUVEC中的表达,为进一步研究脂联素、球状脂联素的功能提供实验基础。方法:应用RT-PCR法自人大网膜脂肪组织的总RNA中扩增出apM1 cDNA全长基因,采用T-A克隆法重组到pGEM-T Vector System中,通过蓝白斑筛选出阳性克隆后,测序鉴定。用PCR法从测序正确的pGEM-T-apM1质粒上,扩增出两端带有sfiI酶切位点的人脂联素基因,再将扩增出的片断亚克隆到T载体上,用sfiI酶切T载体和pCDEF空载体,将酶切后的片断进行连接、转化、筛选、鉴定、测序。将成功构建的pCDEF-apM1质粒转染HEK293细胞,双抗体夹心ELISA法检测培养上清中脂联素的表达水平。以构建好的质粒pGEM T-apM1为模板,PCR扩增出两端带有Xho I和Hind III酶切位点的人球状脂联
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