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生物乙醇作为一种清洁可再生能源,被纳入许多国家的能源发展规划。廉价的原料和高效转化工艺是燃料乙醇商业化生产的必要条件,利用可再生植物纤维资源生物转化制取乙醇的研究成为当前的热点,尤其是利用纤维素生产燃料乙醇,而纤维素糖化液的高效转化和木糖转化成乙醇是关键因素之一。其中木糖的高效乙醇发酵是该技术工业化的基础和制约因素。寻求性能优良的木糖发酵菌株和研究微生物木糖代谢工程成为当前研发的重点。本研究从酒曲和牛粪样品中分别筛选到一个发酵蔗渣糖化液产乙醇的菌株和一个发酵木糖产乙醇的菌株。经形态学分析、理化特性鉴定和分子生物学鉴定,确定这两个菌株分别属于酿酒酵母属(命名为Saccharomyces cerevisiae Q2-1)和热带假丝酵母属(命名为Candida tropicalis H-1)。对S.cerevisiae Q2-1发酵蔗渣糖化液产乙醇的条件进行研究。通过对发酵条件的优化,该菌株在起始pH值为5.5,温度为30℃的条件下,利用含有0.4%硫酸铵的发酵培养基静置发酵60h,发酵率可以达到89.18%,1g蔗渣可以转化成0.136g乙醇。提取Candida tropicalis H-1总DNA,设计引物,通过基因克隆,从C.tropicalisH-1的总DNA上克隆到木糖还原酶基因(xyl1)和木糖醇脱氢酶基因(xyl2),分析这两个基因的序列,没有内含子。将基因xyl1和xyl2插入pPIC3.5K,构建了整合载体pPIC3.5K-xyl1-xyl2,电转化至Pichia stipitis GS115中。xyl1和xyl2通过同源臂交换整合至GS115染色体上,通过菌落PCR筛选,获得了重组子GS115-xyl1-xyl2。木糖还原酶(XR)是NAD(P)H依赖性氧化还原酶,以NADPH或NADH为辅酶,木糖醇脱氢酶(XDH)以NAD~+为专一辅酶。用甲醇诱导重组子表达,通过细胞破碎,收集粗酶液。测得粗酶液中XR和XDH的相对酶活分别为12.3U和1.1U,重组蛋白XR对辅酶NADPH的依赖性要比对辅酶NADH的依赖性大,表明该酶可能为NADPH的依赖型。蛋白酶XDH的活性相对比较高,达到2232.9U。