饲养层细胞在多能干细胞的体外培养中发挥重要的支持作用。传统饲养层细胞的制备方法主要是通过丝裂霉素C和伽玛射线照射处理小鼠胚胎成纤维细胞,使其失去分裂能力。饲养层细胞分泌的生长因子能够抑制多能干细胞的分化,促进自我更新。传统制备饲养层细胞的方法,制备过程复杂、需要饲养小鼠和获取早期胎儿、需要丝裂霉素C或射线照射设备等,这些要求极大制约了饲养层细胞制备方法的应用。本研究首次通过甲醇固定细胞的方法制备饲养层,简化了实验流程,提高了饲养层细胞的制备效率,便于广泛推广应用。实验结果如下:1.甲醇制备饲养层细胞方法的建立通过优化甲醇和丙酮的比例,发现丙酮比例高于70%,不利于饲养层细胞的制备。进一步通过比较甲醇不同浓度对饲养层细胞的影响发现,低浓度的甲醇对细胞的固定作用较弱。结合以上两个结果,最终确定100%的甲醇作为固定饲养层细胞的固定剂。通过比较甲醇温度和固定时间对饲养层细胞,以及多能干细胞生长的影响,确定甲醇的使用温度为4°C,固定时间为5 min。对饲养层细胞密度的优化结果显示甲醇固定的饲养层细胞密度不能低于2×10~4/cm~2。甲醇固定法不仅对小鼠原代成纤维细胞有效,建系的细胞和其他物种的细胞都可以通过甲醇固定法制备成饲养层细胞。2.甲醇固定法制备饲养层细胞用于多能干细胞培养小鼠多能干细胞,包括ES和iPS细胞,都可以在甲醇固定的饲养层细胞上稳定培养。与丝裂霉素C法制备的饲养层相比,小鼠多能干细胞在甲醇固定的饲养层上具有更快的增殖速度、更高的多能基因(Oct4、Nanog、Sox2)表达水平、更多的SSEA-1阳性克隆,并具备体内三胚层分化潜能。人和猪iPS细胞也可以在甲醇固定的饲养层上稳定传代,有正常的克隆形态和稳定的多能基因表达。以上实验结果表明,甲醇固定法制备的饲养层细胞可以替代丝裂霉素C法制备的饲养层细胞,用于小鼠、人、猪等多能干细胞的体外培养。3.甲醇固定法制备饲养层细胞的其他应用饲养层细胞经过甲醇处理后能够牢固地固定在细胞培养皿表面,能够耐受抗性药物和低浓度胰蛋白酶的处理。实验结果表明,在甲醇固定法制备的饲养层细胞上可以快速地用药物处理筛选出稳转多能干细胞株,并且甲醇固定法制备的饲养层细胞在重复利用三次后,小鼠多能干细胞SSEA-1的阳性率仍然高达90%以上。将甲醇固定法制备的饲养层细胞培养板放置在不同温度环境中保存不同时间后,还可以用于多能干细胞的培养。通过检测多能干细胞碱性磷酸酶活性和多能基因的表达,确定甲醇固定法制备的饲养层细胞培养板可以放在室温长期保存。4.甲醇固定法制备饲养层细胞的作用机制饲养层细胞经过甲醇固定后,细胞表面存在有四型胶原和纤维粘连蛋白。甲醇固定的饲养层细胞经过四型胶原酶处理一定时间后,细胞表面的四型胶原和纤维粘连蛋白被降解。小鼠多能干细胞在四型胶原和纤维粘连蛋白被降解的饲养层细胞上贴壁能力明显下降,部分克隆在培养基中处于悬浮状态。多能性检测发现,贴壁能力下降的小鼠多能干细胞退出na?ve状态,出现primed状态。以上结果表明,四型胶原和纤维粘连蛋白被四型胶原酶降解后,多能干细胞在甲醇固定的饲养层上的贴壁能力下降,细胞多能状态发生转变,即甲醇固定的饲养层细胞的胞外基质蛋白对多能干细胞贴壁能力和多能状态的转变有重要影响。