【摘 要】
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大豆植物蛋白具有很高的营养价值,已被广泛用于食品工业中,例如制作面食、烘焙食品、儿童食品、保健食品等。然而,大豆也被列为联合国粮农组织认可的十四种主要食物过敏原之一,大量研究证明,加工可以显著降低大豆中过敏原蛋白的抗原性,精确定位到加工破坏的抗原表位,对大豆过敏人群具有重大意义。本文选用碱溶酸沉的方法从脱脂豆粉中提取大豆球蛋白,将提取的大豆球蛋白经过超高压联合热加工处理,研究加工对大豆球蛋白抗原性
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（NSFC,32172310）；
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大豆植物蛋白具有很高的营养价值,已被广泛用于食品工业中,例如制作面食、烘焙食品、儿童食品、保健食品等。然而,大豆也被列为联合国粮农组织认可的十四种主要食物过敏原之一,大量研究证明,加工可以显著降低大豆中过敏原蛋白的抗原性,精确定位到加工破坏的抗原表位,对大豆过敏人群具有重大意义。本文选用碱溶酸沉的方法从脱脂豆粉中提取大豆球蛋白,将提取的大豆球蛋白经过超高压联合热加工处理,研究加工对大豆球蛋白抗原性和结构性的影响。采用SDS-PAGE、外源荧光、游离巯基和傅立叶红外等方法检测加工对大豆球蛋白结构的影响,通过酶联免疫吸附测定（ELISA）和免疫印迹检测加工对大豆球蛋白抗原性的影响,用体外模拟消化实验评估加工后大豆球蛋白的消化稳定性。结果显示,与未加工的样品相比,加工后的大豆球蛋白二硫键断裂,分子量发生变化,随着温度的逐渐升高,酸性肽链条带逐渐变浅直至消失;蛋白样品中的疏水基团、游离巯基、α-螺旋、β-转角和无规卷曲的含量增加,β-折叠含量减少。当温度到达130°C时,蛋白质抗原的抑制率达到37%,比未处理的蛋白质抗原降低50%,抗原抑制率达到最低。经过体外模拟消化评估,加工可以显著降低大豆球蛋白的抗原性。通过NCBI数据库检索A2肽链的氨基酸序列,结合生物信息学对其重叠分段,将A2肽链相邻片段重叠约135个碱基,将其分为A2-1,A2-2,A2-3三个片段,使用pr imer 5软件设计引物,将A2全长及其重叠分段PCR扩增后的基因胶回收,与T载体相连构建克隆载体转化到大肠杆菌,将转化成功的阳性菌扩大培养提取质粒,酶切后与T7噬菌体载体臂相连,体外包装后侵染大肠杆菌,得到阳性重组噬菌体,扩大培养后得到A2肽链及其重叠分段基因的噬菌体蛋白。在破坏抗原最强的加工条件下,将过量的热加工和联合处理的大豆球蛋白与多抗血清充分混合吸收,得到两种加工破坏抗原表位的特异性抗体。将加工破坏的多抗血清与噬菌体蛋白反应,初步定位加工破坏表位的优势抗原区域为A2-3片段,该片段的氨基酸序列为201SGFAPEFLKEAFGVNM QIVRNLQGENEEEDSGAIVTVKGGLRVTAPAMRKPQQEEDDDDEEEQPQCVETDKG CQRQSK278。将A2-3片段重叠15个碱基将其分为A2-3-A、A2-3-B、A2-3-C三个片段,再次筛选加工破坏的抗原优势区域,最终精确定位到加工破坏的抗原优势区域为A2-3-B片段,该片段的氨基酸序列为233AIVTVKGGLRVTAPAMRKPQQEEDDDDEE EQPQCVE268。通过在线分析软件预测A2-3-B片段的二级结构,该片段中含有11.11%的α-螺旋、25%的β-折叠和63.89%的无规卷曲,将A2-3-B相互重叠约18个碱基分为3个肽段,由Dot-Blot和ELISA检测结果可知,多抗血清和肽3反应但和肽1、肽2不反应,说明在肽1和肽2中不含与大豆球蛋白多抗血清结合的线性抗原位点,肽3中含有抗原线性表位,两种加工破坏的抗体与3条肽都不反应,说明加工并未破坏与三条肽结合的线性表位,通过噬菌体表达出A2-3-B片段能与加工破坏的特异性抗体反应,说明在该片段中含有加工破坏的构象表位,而对应的线性抗原表位未被破坏。与过敏患者血清反应,发现肽3具有致敏性,肽3片段的氨基酸序列为253QEEDDDDEEEQPQCVE268,采取丙氨酸替代技术对肽3定点突变,经过Dot-Blot和ELISA检测显示,当第2(D259),3(E260),4(E261),6(Q263),9(C266)位的氨基酸突变后,突变后的肽段不与大豆球蛋白多抗血清发生特异性结合,D259,E260,E261,Q263和C266可能是显著影响肽3抗原性的关键氨基酸。
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