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鳖甲(Trionyx sinensis carapace)为药食两用传统中药,收载于历年版《中国药典》,具有滋阴潜阳、软坚散结、退热除蒸的功效。鳖甲为中医临床治疗肝纤维化疾患的常用中药,以鳖甲为君药的多种中药复方制剂,如鳖甲软肝片、鳖甲抗纤方、鳖甲煎丸等用于肝纤维化疾患,疗效较好。本实验室前期研究表明,鳖甲的水煎煮液对肝纤维化大鼠模型具有较好的治疗作用；并首次从鳖甲水提物中分离和筛选出了三种抗肝纤维化活性肽类化合物,经结构鉴定分别为A:H-G-R-F-G (572.3)、B:N-P-N-P-T (542.16)、C:N-D-D-Y (526.2).本论文在实验室前期研究基础上,以鳖甲中分离鉴定的三种活性肽成分A、B、c为先导化合物,采用Fmoc固相合成方法,得到了三种合成肽,其纯度达98%以上；经高分辨率质谱仪鉴定其分子量与理论值一致,且其裂解的碎片离子序列与先导化合物一致；以肝星状细胞药理模型为受试对象,采用MTS比色法和酶联免疫吸附法(ELISA)对三种合成肽进行活性筛选,结果显示合成肽A (H-G-R-F-G)、B (N-P-N-P-T)具有较强的抗肝纤维化作用。采用免疫印迹法(Western-blot)和Annexin V-FITC/PI法,探讨了合成肽A(H-G-R-F-G)和B(N-P-N-P-T)对Col Ⅰ、ColⅢ、Smad3、p-Smad3、 a-SMA、TIMP-1和MMP-1蛋白表达的影响和对肝星状细胞(HSC)凋亡的影响。研究结果表明,合成肽A和B通过以下三种途径发挥抗肝纤维化药效作用：①使TGF-β1刺激的肝星状细胞Col Ⅰ、ColⅢ及α-SMA蛋白的表达明显下调,减少其Col Ⅰ、ColⅢ的合成与分泌；②使TGF-β1刺激的p-Smad3蛋白表达显著减少,从而减少Smad3蛋白磷酸化和ECM基因转录；③使TGF-β1刺激的肝星状细胞TIMP-1的表达明显降低,而MMP-1的表达升高,从而增强MMP-1的活性和降低TIMP-1的作用,促进ECM的降解。上述研究结果阐释了化学合成的鳖甲活性肽A和B的抗肝纤维化作用机理。针对小分子合成肽在体内存在免疫原性、作用时间短及稳定性差等问题,对合成肽A进行了化学结构修饰研究。采用Fmoc固相合成方法,以非天然D型氨基酸替换合成肽A结构中对应的L型氨基酸,得到七种肽的结构修饰产物,并对七种结构修饰产物在不同温度、不同缓冲液种类及不同pH环境进行稳定性考察,研究结果表明,与合成肽A比较,其稳定性均明显增强；采用CCK-8比色法,对化学结构修饰产物进行了抗肝纤维化筛选研究,结果表明均有较好的生物活性,与合成肽A比较,无显著性差异,但结构修饰产物具有稳定性较强的优势。因此,本项研究结果为进一步研究抗肝纤维化药物提供了参考依据。