人胰岛素原(1uman proinsulin, HPI)是由109个氨基酸组成的单链无糖基化的蛋白质,分子量约为12kD。HPI是人体唯一降血糖激素胰岛素的前体蛋白,体内和体外的研究均发现其能够有效降低胰高血糖素刺激的糖原分解,并结合胰岛素受体发挥生物学效应。人体内胰岛素水平的长期失衡容易引起糖尿病,随着人类社会的不断发展和人民生活水平的不断提高,糖尿病的患者人数也在不断上升,其中中国已经成为世界上糖尿病患者最多的国家,2010年中华内分泌学会和国家疾病控制中心调查18岁以上人群糖尿病患病情况,显示糖尿病患病率仍为9.7%。目前治疗糖尿病患者的方法主要是胰岛素的皮下注射和其他治疗,胰岛素的皮下注射给患者带来了极大的精神痛苦,也容易引起高胰岛素血症、体重增加和低血糖等并发症,并且糖尿病患者的治疗费用昂贵(美国每名糖尿病患者的年治疗费用达11744美元),因此越来越多的研究开始专注于口服胰岛素制剂的开发,但是口服蛋白药物必须克服胃肠道极端环境对药物的破坏和吸收低下两大问题。枯草芽孢杆菌是一种非致病性革兰氏阳性益生菌,在极端环境的胁迫下能形成具有抗逆性的休眠体—芽孢。芽孢在酸性胃的环境中可以保持活力。这样它也能耐唾液和胆汁中各种消化酶的攻击,从而顺利直达肠道,所以已逐渐发展成胃肠道等极端环境下各种异源蛋白的有效载体。因此,本研究利用芽孢的抗逆性,根据人体肠道的消化特征,将带有肠激酶标签Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的多肽胰岛素原展示在芽孢表面,构建具有益生菌营养功能的表面展示HPI多肽的降血糖重组芽孢,期望该多肽人胰岛素原能够在肠道内进行自由地消化吸收。本研究的主要内容和结果如下：(1)利用软件Primer 5.0设计带有Nco Ⅰ和Sac Ⅰ酶切位点的特异性引物,通过PCR方法扩增获得人胰岛素原hpi基因,然后送公司测序,并在数据库中比对鉴定到正确序列。(2)通过构建质粒pET30a-HPI,酶切后人胰岛素原基因hpi的前端被加上肠激酶位点。然后克隆到质粒pJS700载体上,构建整合型重组质粒pJS700-HPI。转化Bacillus subtilis感受态细胞之后,用抗生素筛选后进行PCR鉴定。并结合淀粉酶活性分析等相关实验得到重组菌株Bacillus subtilis/pJS700-HPI。用DSM培养基诱导培养该重组菌株产生芽孢,通过免疫印迹和免疫荧光进一步分析鉴定该重组芽孢表面展示有人胰岛素原。这些实验说明本研究成功获得胰岛素原展示的重组芽孢。(3)5龄眠起家蚕进行葡萄糖溶液的微量注射,部分家蚕取血用葡萄糖氧化酶法测量不同时间点家蚕血液对葡萄糖的代谢情况,结果显示家蚕能够代谢利用葡萄糖。剩余家蚕继续注射葡萄糖溶液,持续3天后,测定家蚕的体重、体长和血液总糖浓度,结果显示高血糖(9mg/ml)能够明显抑制家蚕的生长发育,相比正常组家蚕(血糖6mg/ml左右)其体重下降了1/3左右(约0.35 g)。(4)利用二维电泳技术全面分析比较正常组家蚕和高血糖模型家蚕中肠的总蛋白,并结合质谱技术对差异表达蛋白进行鉴定。用GO分析方法来比较所鉴定差异蛋白的代谢和催化特性,并在转录水平上进行验证,结果显示家蚕成虫盘生长因子(IDGF)与糖代谢关系紧密,进一步用家蚕中肠蛋白的western blot实验也证明了IDGF在高糖饮食抑制家蚕正常生长过程中起到重要作用。(5)通过发酵培养获得大量重组芽孢并制成菌悬液,然后用移液枪对已构建的高血糖模型家蚕进行口服实验,持续3天,家蚕血清糖度测定结果显示口服重组芽孢能够使家蚕血糖浓度到从9mg/ml下降到6mg/ml左右,恢复到正常组水平,说明重组芽孢能够明显降低高血糖模型家蚕的血糖水平。(6)通过腹腔注射链脲佐菌素溶液构建小鼠糖尿病模型,然后进行重组芽孢的灌胃实验。实验结束后对各组小鼠进行眼眶取血,分析胰岛素原所展示的重组芽孢对小鼠血糖等生理指标的影响。结果显示口服重组芽孢能够明显降低糖尿病模型小鼠的血糖水平到2.5 mg/ml左右,并提高其血清胰岛素的含量到6.72 μIU/ml,说明口服重组芽孢对糖尿病小鼠具有一定程度的降血糖功效。