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苹果轮纹病是世界上最严重的苹果病害之一,它主要是由Botryosphaeria dothidea(B.dothidea)引起的。苹果是我国的主要经济作物,在苹果的生产过程中,苹果轮纹病能够造成苹果果实产量和品质的显著下降,导致严重的经济损失。因此,研究苹果对轮纹病的抗性机制对于提高苹果果实的产量和品质具有重要的意义。前人研究表明,泛素化途径在多种生物胁迫反应中发挥着关键作用。泛素化是由泛素激活酶E1,泛素结合酶E2和泛素连接酶E3通过一系列的酶促级联反应完成的。其中,E3泛素连接酶决定了靶蛋白的特异性,从而促进了下游靶蛋白的泛素化。本研究中,我们报道了一个苹果BTB-BACK结构域的E3泛素连接酶蛋白POZ/BTB CONTAINING-PROTEIN 1(MdPOB1),通过转基因的方法研究了它在苹果对病原菌B.dothidea的防御方面发挥的作用。并通过体内和体外实验研究了MdPOB1蛋白在苹果轮纹病抗性机制中发挥作用的分子机理。主要研究工作和结果如下:1.MdPOB1抑制苹果对B.dothidea的防御能力生物信息学分析显示,MdPOB1(基因序列号:MD07G1143200)含有一个保守的BTB-BACK结构域,并且与AtPOB1具有较高的同源性。通过农杆菌介导的遗传转化获得了MdPOB1过量表达(MdPOB1-OVX)和抑制表达(MdPOB1-ANTI)的苹果愈伤组织,并通过瞬时注射的方法获得了过量表达(MdPOB1-IL60)和抑制表达(MdPOB1-TRV)的瞬时转化苹果果实。接种B.dothidea后发现,过量表达的苹果愈伤组织和苹果果实均降低了对它的防御能力,而抑制表达的苹果愈伤组织和苹果果实均提高了对它的防御能力。说明MdPOB1能够抑制苹果对B.dothidea的防御能力。2.MdPOB1蛋白与MdPUB29蛋白互作并能够将其泛素化降解为了探究MdPOB1抑制苹果对B.dothidea防御能力的分子机制,首先利用酵母双杂交的方法筛选到了一个苹果U-box结构域的E3泛素连接酶MdPUB29与MdPOB1蛋白互作,并通过pull-down实验和双分子荧光互补实验进一步验证了MdPOB1蛋白与MdPUB29蛋白之间的互作。体外蛋白降解实验以及体内泛素化实验表明MdPOB1蛋白能够通过泛素/26S蛋白酶体途径促进MdPUB29蛋白的降解。3.MdPUB29增强苹果对B.dothidea的防御能力生物信息学分析显示,MdPUB29(基因序列号:MD01G1010900)含有一个保守的U-box结构域,并且与AtPUB29亲缘关系最近,同源性最高。亚细胞定位显示MdPUB29定位于细胞核中。通过农杆菌介导的遗传转化获得了MdPUB29过量表达(MdPUB29-OVX)和抑制表达(MdPUB29-ANTI)的苹果愈伤组织,以及异位表达MdPUB29的拟南芥植株。接种B.dothidea后发现,过量表达的苹果愈伤组织和转基因拟南芥植株均提高了对B.dothidea的防御能力,而抑制表达的苹果愈伤组织则降低了对B.dothidea的防御能力。说明MdPUB29能够增强苹果对B.dothidea的防御能力。4.MdPOB1以依赖于MdPUB29的方式抑制苹果对B.dothidea的防御能力为了进一步研究MdPOB1抑制苹果对B.dothidea防御能力的机制,通过瞬时注射的方法获得了MdPOB1抑制表达(MdPOB1-TRV),MdPUB29抑制表达(MdPUB29-TRV)以及MdPOB1和MdPUB29共同抑制表达(MdPOB1-TRV+MdPUB29-TRV)的瞬时转化苹果果实。接种B.dothidea后发现,单独抑制MdPOB1表达的苹果果实提高了对它的防御能力,而单独抑制MdPUB29表达以及共同抑制MdPOB1和MdPUB29表达的苹果果实均降低了对它的防御能力。说明MdPOB1以依赖于MdPUB29的方式抑制苹果对B.dothidea的防御能力。