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马铃薯为世界第四大粮食作物,在种植过程中易受病毒感染。马铃薯纺锤茎块类病毒(Potato spindle tuber viroid,PSTVd)是一种严重危害马铃薯生产的类病毒,当前对PSTVd的生物学特性、检测技术、基因组预测序等研究已较成熟,但其复制、转运及致病机理尚不明晰。PSTVd基因组中包含27个茎环结构,其具体功能尚不明晰。基于病毒、类病毒结构简单、RNA分子较小的特殊性.利用病毒、类病毒进行RNA二级结构及功能研究是当前研究中的热点。本研究通过RT-PCR技术,获得了一个PSTVd分离物;并通过关闭PSTVd的部分茎环结构获得不同突变体,之后利用原位杂交技术、荧光定量PCR技术了解了关闭茎环结构对PSTVd转运与复制的影响;此外,也基于高通量测序技术分析了 PSTVd在烟草中的变异特点。主要研究内容如下:(1)以马铃薯块茎为实验材料,提取总RNA,通过RT-PCR扩增得到359bp特异性条带,后经过克隆、测序,显示此分离物与GenBank中其它PSTVd分离物的同源性为 96.5%-98.1%。(2)以烟草叶片为实验材料,利用纤维素酶和果胶酶制备的酶液避光酶解烟草叶片,再用400目的网筛过滤混合液,W5溶液清洗后离心,制备烟草原生质体。将原生质体悬浮于MMg溶液中,通过聚乙二醇法将PSTVd RNA成功导入到烟草原生质体中。过夜培养,提取总RNA,利用荧光定量PCR技术可有效分析不同PSTVd突变体的复制能力。制备10个关闭不同茎环结构的PSTVd突变体。利用体外转录技术,将闭环突变体质粒转录成类病毒RNA,以摩擦接种的方式接种烟草叶片,3周后取叶片组织制备冰冻切片,利用原位杂交技术分析PSTVd在烟草各组织中的分布。结合原位杂交、荧光定量PCR结果,显示Loop4的复制能力受到明显影响、转运能力被破坏;Loop6的复制能力受到影响、转运能力受到影响:Loop17、Loop18复制能力未受到明显影响、转运能力被破坏;Loop20复制能力未受到明显影响、转运能力受到影响;Loop10、LoopI2、Loop24、Loop25、Loop26复制能力受到影响、转运能力被破坏。推测Loop4功能与复制相关:Loop17、Loop18、Loop20功能与转运相关;Loop6、Loop10、Loop12、Loop24、Loop25、Loop26 功能与复制、转运均相关。(3)以16粒被PSTVd侵染烟草植株所得到的种子为实验材料,利用RT-PCR技术对单种子中的PSTVd进行了检测,16个样品均得到359bp的PSTVd特异性条带,显示PSTVd侵染过的烟草植株的种子带毒率为100%。利用原位杂交技术对种子中的PSTVd进行定位,结果显示PSTVd主要分布在种皮,未进入胚。以PSTVd侵染过的烟草植株所得到的种子为试材,经种植获得烟草幼苗,RT-PCR检测结果显示各植株皆未受PSTVd感染。结合RT-PCR及原位杂交结果,显示烟草种皮可携带PSTVd,但PSTVd不能通过烟草种子传播至幼苗。(4)以被PSTVd侵染2个月的烟草植株为实验材料,提取叶片总RNA,利用高通量测序技术分析类病毒在烟草植株中的变异情况。共获得了 20个突变位点,主要位于PSTVd基因组二级结构的左末端区和致病区,以及中央保守区和可变区的连接处,突变类型包括碱基不定向突变、碱基定向突变、碱基缺失及突变、碱基缺失、碱基插入及突变5种突变类型,其中碱基定向突变的位点有13个,在5种突变类型中最多。多数突变引起了 PSTVd RNA二级结构的变化。