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目的:通过观察甘露消毒丹(GXM)及其挥发油对甲型流感病毒(IV)感染小鼠的治疗作用和对炎症细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-6、TNF-α表达影响的实验研究,以探讨中药复方GXM及其挥发油在免疫调节过程中对细胞因子的影响机制,为临床防治IV提供实验依据。方法:(1)鼻腔接种甲型流感病毒鼠肺适应株(FM1),诱导小鼠形成IV感染模型。用实时荧光定量聚合酶链反应技术(RT-PCR)复制肺组织中病毒量并检测其表达,结合肺组织外观、肺组织病理光镜及电镜下的结果和肺指数、肺湿干比等指标的定期测定,鉴定小鼠IV感染模型。(2)GXM及其挥发油通过不同给药途径以治疗IV感染小鼠,将小鼠随机分为6组,分别为正常组、模型组、GXM灌胃组、GXM滴鼻组、GXM合用组、奥司他韦组,观察小鼠的一般状态,如体重变化、活动状态、毛发、食欲、死亡数等,于造模后第3、7、10天进行取材,摘取小鼠肺脏,称重,计算肺指数和肺干湿比;以染色(苏木素伊红染色)法观察肺组织病理炎症程度并进行评分;通过透射电子显微镜对肺组织进行检测以及图像分析;采用RT-PCR检测肺组织中病毒载量的表达情况,结合以上结果阐明GXM及其挥发油对IV感染小鼠的治疗作用。(3)采用ELISA方法,检测各组小鼠不同时间点血清中IFN-γ、IL-4、IL-6、TNF-α表达情况,以初步探讨GXM及其挥发油在抗IV感染的免疫调节过程中细胞因子的调控作用。结果:1.模型复制:正常组小鼠的精神状态、身体健康状况基本与前一致,接种IV后的小鼠均在不同时间,不同程度的出现呼吸、动作、饮食及体重等方面的改变,感染3天后,模型组小鼠肺组织中检测到大量IV表达,与正常肺组织比较,可见其肺指数升高,干湿比降低,肺病理改变呈血肿、渗出,肺泡隔增厚与炎性细胞浸润病变,肺组织超微结构可见Ⅱ型细胞坏死、结构不完整,血管肿胀,肺泡腔内游离性纤毛增粗、脱落、稀少,形成肺部炎症。2.GXM及其挥发油对IV感染小鼠的治疗作用(1)IV感染小鼠的一般状态改善,治疗作用明显。(2)在保护肺组织病理性改变方面:各治疗组肺指数、肺干湿比、病理评分均异于模型组,有显著性差异(P<0.05),在不同时间,各治疗组肺指数及肺干湿比均有不同程度的改善,综合比较,GXM各组总体疗效见:GXM合用组>GXM灌胃组>GXM滴鼻组。光镜下观察肺组织形态表明,治疗组肺组织病变较模型组均明显减轻,尤以合用组疗效显著。电镜下观察肺组织超微结构可见治疗组Ⅱ型肺泡细胞较正常组增多,核及核仁形态基本正常,异染色体聚集在核周,细胞内板层小体形态规整,细胞游离面微绒毛较丰富,肺泡隔增厚不明显,间质内见少量的胶原纤维,GXM各治疗组和奥司他韦组肺组织病变较模型组均明显减轻。(3)在抑制病毒复制方面:正常组肺组织中未检测到IV病毒核酸;模型组在感染后第3天检测到大量IV RNA表达,达到高峰,后呈下降趋势;GXM各治疗组和奥司他韦组均低于模型组,且差异具有显著性(P<0.05),GXM合用组较奥司他韦组略高,存在差异(P<0.05),与其相比,GXM灌胃组、滴鼻组病毒载量较高,差异有统计学意义(P<0.05),在第3天GXM灌胃组病毒量高于GXM滴鼻组,于第7、10天检测到其含量均低于GXM滴鼻组,可见其作用慢,然持久。GXM各组总体疗效见:GXM各治疗组疗效总体可见:GXM合用组>GXM灌胃组>GXM滴鼻组。(4)采用ELISA法检测各组小鼠各时间点血清中IFN-γ、IL-4、IL-6、TNF-α水平,结果示:与正常对照组比较,模型组小鼠在各时间点的血清IFN-γ、IL-4、IL-6、TNF-α表达均显著升高(P<0.05),于第3、7天达峰值;与模型组比较,第3天,GXM滴鼻组、GXM合用组、奥司他韦组的IL-4、IL-6、TNF-α水平均有显著降低(P<0.05),而GXM灌胃组作用效果最末;第7天、10天,各治疗组均有所降低(P<0.05),且GXM灌胃组疗效优于GXM滴鼻组。与模型组比较,各治疗组小鼠不同时间点的血清IFN-γ均显著升高。第3天,与GXM合用组相比,GXM灌胃组、GXM滴鼻组具有显著性差异(P<0.05),并且GXM灌胃组疗效最差;第7天、10天,各GXM治疗组比较,GXM合用组效果最佳,这两个时间点GXM灌胃组作用效果明显上升,并且优于GXM滴鼻组,综上见GXM各治疗组疗效总体可见:GXM合用组>GXM灌胃组>GXM滴鼻组。结论:1.采用甲型流感病毒FM1株经鼻腔连续滴鼻的方法可以成功造出BALB/c小鼠IV感染模型。用组织形态学观察,及计算肺指数、肺干湿比及RT-PCR复制病毒核酸并检测其表达,为鉴定IV感染小鼠模型提供了客观依据。2.GXM及挥发油能明显减轻流感病毒FM1感染小鼠肺组织病变,改善肺指数及肺干湿比,降低小鼠肺组织中的病毒载量。表明GXM及其挥发油对IV感染所致小鼠肺损伤有明显的治疗作用。3.GXM及挥发油相对模型组而言均能降低小鼠血清中IL-4、IL-6和TNF-α的表达,上调IFN-γ含量表达,且在GXM各治疗组间,GXM合用组疗效更佳显著,提示GXM及挥发油可以调控炎症因子的释放,抑制IV对肺部的损伤,预防IV的入侵,同时抑制了IV病毒在体内的复制。