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水稻(Oryza sativa L.)是世界范围内重要的粮食作物,在粮食生产和消费中占有重要地位,为了维持和提高水稻产量,大量氮肥施入农田生态系统中。土壤硝化作用的进行导致硝酸盐的大量生成和农田氮素养分的流失,造成作物氮素利用率降低,并带来水体污染、温室气体排放等环境问题。合成硝化抑制剂能够抑制农田硝化过程,但存在成本高、污染风险大等不足,因此,研究和开发高效、环境友好的生物硝化抑制剂对减少农田氮素损失和提高作物氮素利用效率具有十分重要的意义。前人研究表明水稻根系分泌物具有硝化抑制效应,并首次揭示了脂肪醇类化合物1,9-癸二醇是水稻根系分泌物中抑制氨氧化微生物的活性物质,然而其环境调控因子尚不清楚,并且源于水稻根系的其它生物硝化抑制剂也有待继续挖掘。
本研究以水稻-硝化微生物根际化学对话为主线,利用化学、微生物学和分子生物学等相关研究手段,重点研究了水稻生物硝化抑制剂1,9-癸二醇定量方法的优化及该物质分泌的环境调控,挖掘了根系分泌物中其他生物硝化抑制剂,分析了其作用机制及应用效果,并进一步探讨了1,9-癸二醇与该生物硝化抑制剂之间的相互作用。主要研究结果如下:
(1)针对水稻生物硝化抑制剂1,9-癸二醇的定量方法,研究发现,相比于旋转蒸发法,采用固相萃取法富集水稻根系分泌物收集液中的1,9-癸二醇,具有高效省时的特点,其对1,9-癸二醇的回收率为82.97%;对1,9-癸二醇的衍生化方法进行进一步优化,结果表明加入200μL N,O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA),烘箱加热60℃条件下反应30 min时,衍生化产物经气相色谱仪测定具有较好的响应;该定量方法仪器的日内精密度为2.18%,日间精密度为3.01%,线性方程为y=34.77x-0.90,r=0.9993,最小检出限为0.05μg mL-1,该方法操作简便、灵敏度高,可用于水稻根系分泌物中生物硝化抑制剂1,9-癸二醇的定量研究。
(2)水稻根系生物硝化抑制剂1,9-癸二醇的分泌受多种环境因素的影响。根际NH4+水平(0~1mM)和低pH能够促进1,9-癸二醇的分泌,而NO3-对1,9-癸二醇的分泌并无影响;不同于其它旱作植物(例如高粱、湿生臂形草等),水稻根系局部供NH4+能够诱导整株根系分泌1,9-癸二醇;为根系提供充足的氧气,能够有效促进1,9-癸二醇的分泌,使其含量提高了将近63%;水稻与微生物共同培养实验表明,亚硝化单胞菌能够促进水稻根系分泌1,9-癸二醇,而反硝化细菌对1,9-癸二醇的分泌并没有影响。
(3)通过GC-MS对比典型水稻品种根系分泌物中活性物质的差异,从具有强硝化抑制效应的水稻武运粳7中(WYJ7)鉴定到一种酚酸类化合物PA1,该物质在弱酸条件下具有较强的硝化抑制效果,pH6.0时,其抑制效果最强,能抑制氨氧化过程中的氨单加氧酶(AMO)途径,ED80为400 ngμL-1;土壤培养实验表明,PA1能够抑制土壤中的AOA和AOB的丰度而抑制硝化过程,具有可观的硝化抑制效果。
(4)亚硝化细菌培养实验表明,将水稻生物硝化抑制剂PA1和1,9-癸二醇组合添加,具有更好的硝化抑制效果。在一定浓度范围内,两种物质具有协同作用,且协同效应与pH值呈正相关,在pH8.0时,协同效应最强,可达10~19%,PA1能够显著促进1,9-癸二醇的硝化抑制活性。
本研究以水稻-硝化微生物根际化学对话为主线,利用化学、微生物学和分子生物学等相关研究手段,重点研究了水稻生物硝化抑制剂1,9-癸二醇定量方法的优化及该物质分泌的环境调控,挖掘了根系分泌物中其他生物硝化抑制剂,分析了其作用机制及应用效果,并进一步探讨了1,9-癸二醇与该生物硝化抑制剂之间的相互作用。主要研究结果如下:
(1)针对水稻生物硝化抑制剂1,9-癸二醇的定量方法,研究发现,相比于旋转蒸发法,采用固相萃取法富集水稻根系分泌物收集液中的1,9-癸二醇,具有高效省时的特点,其对1,9-癸二醇的回收率为82.97%;对1,9-癸二醇的衍生化方法进行进一步优化,结果表明加入200μL N,O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA),烘箱加热60℃条件下反应30 min时,衍生化产物经气相色谱仪测定具有较好的响应;该定量方法仪器的日内精密度为2.18%,日间精密度为3.01%,线性方程为y=34.77x-0.90,r=0.9993,最小检出限为0.05μg mL-1,该方法操作简便、灵敏度高,可用于水稻根系分泌物中生物硝化抑制剂1,9-癸二醇的定量研究。
(2)水稻根系生物硝化抑制剂1,9-癸二醇的分泌受多种环境因素的影响。根际NH4+水平(0~1mM)和低pH能够促进1,9-癸二醇的分泌,而NO3-对1,9-癸二醇的分泌并无影响;不同于其它旱作植物(例如高粱、湿生臂形草等),水稻根系局部供NH4+能够诱导整株根系分泌1,9-癸二醇;为根系提供充足的氧气,能够有效促进1,9-癸二醇的分泌,使其含量提高了将近63%;水稻与微生物共同培养实验表明,亚硝化单胞菌能够促进水稻根系分泌1,9-癸二醇,而反硝化细菌对1,9-癸二醇的分泌并没有影响。
(3)通过GC-MS对比典型水稻品种根系分泌物中活性物质的差异,从具有强硝化抑制效应的水稻武运粳7中(WYJ7)鉴定到一种酚酸类化合物PA1,该物质在弱酸条件下具有较强的硝化抑制效果,pH6.0时,其抑制效果最强,能抑制氨氧化过程中的氨单加氧酶(AMO)途径,ED80为400 ngμL-1;土壤培养实验表明,PA1能够抑制土壤中的AOA和AOB的丰度而抑制硝化过程,具有可观的硝化抑制效果。
(4)亚硝化细菌培养实验表明,将水稻生物硝化抑制剂PA1和1,9-癸二醇组合添加,具有更好的硝化抑制效果。在一定浓度范围内,两种物质具有协同作用,且协同效应与pH值呈正相关,在pH8.0时,协同效应最强,可达10~19%,PA1能够显著促进1,9-癸二醇的硝化抑制活性。