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胃癌(gastric cancer)是最常见的恶性肿瘤之一,多种因素参与了该肿瘤的形成和发生,也涉及到了多种相关蛋白的表达和功能异常,具体的发病原因和机制目前还不清楚。虽然近年来胃癌的发病率在全世界范围内有所下降,但是在许多亚洲国家包括中国在内,胃癌的发病率仍居高不下。目前临床治疗胃癌的手段主要是手术、化疗及放疗等,尽管近年来基础和临床研究使胃癌的早期诊断及治疗效果取得很大进步,但提高胃癌患者的5年生存率仍是临床治疗的难题。由于胃癌早期症状不明显,患者被诊断时已是晚期或错过了最佳治疗机会。因此,寻找特异性、灵敏性高,毒副作用小的治疗药物尤为重要。天然药物具有副作用少、安全、廉价等优点,近年来在抗肿瘤研究中备受关注。九节龙皂苷(ardipusilloside,ADS)是从天然植物金牛科紫金牛属植物川产九节龙Ardisia pusilla中提取的一种天然化合物。大量研究证明,ADS具有抗肿瘤、降血压、抗病毒等多种生物学和药理学功能。越来越多的研究报道,九节龙皂苷-Ⅰ(ardipusilloside-Ⅰ,ADS-Ⅰ)对肺癌、肝癌、人脑胶质瘤、人子宫颈癌等多种肿瘤具有抑制作用,其抗肿瘤作用的主要机制有诱导细胞程序性死亡(PCD),诱导细胞自我吞噬,抑制肿瘤的侵袭和转移等。本研究首先观察了ADS-Ⅰ对人类胃癌TSGH、N87细胞增殖、侵袭、迁移及上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响,又进一步探索了ADS-Ⅰ对胃癌影响的分子机制,最后建立了胃癌N87细胞移植瘤,以进一步研究ADS-Ⅰ对胃癌移植瘤的影响及机制。本文最终确立了ADS-Ⅰ可能通过JAK/STAT3信号通路调控胃癌生长、侵袭、迁移及EMT,为胃癌的治疗提供了新的思路,为ADS-Ⅰ的抗肿瘤特性提供了新的依据。本研究共分以下三个部分。第一部分九节龙皂苷-Ⅰ对胃癌细胞增殖、侵袭、转移及上皮间质转化的影响方法1.利用MTT法检测不同浓度的ADS-I(10、20、40μM)处理胃癌TSGH、N87细胞24,48,72,96h后,对胃癌细胞增殖能力的影响,对照组为不含ADS-I的生理盐水。2.利用Transwell小室法检测不同浓度的ADS-I(10、20、40μM)处理胃癌TSGH、N87细胞24h后,对胃癌细胞侵袭能力的影响,主要是通过观察细胞穿透基质胶的数目判定胃癌细胞的侵袭能力。3.采用细胞划痕实验检测ADS-Ⅰ对胃癌TSGH、N87细胞迁移能力的影响,10、20及40μM的ADS-Ⅰ处理胃癌TSGH、N87细胞24h后,通过细胞的划痕距离的变化检测细胞的迁移能力。4.Western blot检测不同浓度ADS-Ⅰ(10、20、40μM)处理胃癌TSGH细胞24h后,通过EMT相关标记物E-钙粘蛋白和N-钙粘蛋白的表达来判断ADS-Ⅰ对胃癌细胞上皮间质转化的影响。结果1.MTT检测结果显示,不同浓度ADS-Ⅰ(10、20、40μM)处理,可以显著抑制胃癌TSGH、N87细胞的增殖。2.Transwell小室法检测细胞侵袭的结果显示,不同浓度ADS-Ⅰ(10、20、40μM)处理胃癌TSGH、N87细胞24h后,可以显著减少细胞穿透基质膜的数量。3.细胞划痕实验结果显示,不同浓度ADS-Ⅰ(10、20、40μM)处理胃癌TSGH、N87细胞24h后,可以显著抑制细胞的迁移能力。4.Western blot结果显示,不同浓度ADS-Ⅰ(10、20、40μM)处理胃癌TSGH细胞24h后,可以显著提高E-钙粘蛋白的表达,同时降低N-钙粘蛋白的表达,ADS-Ⅰ能够抑制胃癌的上皮细胞间质转化。第二部分九节龙皂苷-Ⅰ对胃癌细胞内JAK/STAT3信号通路的影响方法1.Western blot检测不同浓度的ADS-Ⅰ(10、20、40μM)处理胃癌TSGH细胞24h后,对细胞内p-JAK1、JAK1、p-JAK2、JAK2、p-STAT3及STAT3蛋白表达的影响。2.实时荧光定量PCR检测不同浓度的ADS-Ⅰ(10、20、40μM)处理胃癌TSGH细胞24h后,对细胞内Ki67、Bcl-2、MMP-9、Snail及Twist m RNA表达的影响。结果1.Western blot检测结果显示,ADS-Ⅰ可以抑制胃癌TSGH细胞内p-JAK1、p-JAK2及p-STAT3蛋白的表达,即ADS-Ⅰ可以抑制细胞内JAK/STAT3信号通路的活性。2.ADS-Ⅰ可以在m RNA水平上抑制Ki67、Bcl-2、MMP-9、Snail及Twist基因的表达。第三部分九节龙皂苷-Ⅰ对胃癌移植瘤的影响方法1.胃癌N87细胞裸鼠移植瘤模型的建立:采用BALB/c-nu裸鼠20只,每只裸鼠腋窝皮下注射200μL胃癌N87细胞(密度为3×106个/m L),待移植瘤体积大于100mm3时,将移植瘤模型分为对照组和处理组,对照组每日灌胃生理盐水200μL,处理组灌胃ADS-Ⅰ50mg/kg,每日1次,连续12天。2.每3日用游标卡尺测量移植瘤的最长径(a)和最短径(b)并观察肿瘤体积的变化,移植瘤体积的计算公式为:Tumor volume(mm3)=(the longest diameter)×(the shortest diameter)2/2。动物用药结束2天后,颈椎脱臼处死动物后剖取肿瘤块,称取每只裸鼠肿瘤块的重量,冷冻保存。3.Western blot检测对照组和ADS-Ⅰ处理组胃癌移植瘤中JAK/STAT3信号通路蛋白p-JAK1、JAK1、p-JAK2、JAK2、p-STAT3及STAT3蛋白的表达情况。4.Western blot检测对照组和ADS-Ⅰ处理组胃癌移植瘤中Ki67、Bcl-2、MMP-9、Snail及Twist蛋白表达情况。结果1.与对照组相比,使用50mg/kg的ADS-Ⅰ灌胃给药,显著抑制了胃癌N87细胞裸鼠移植瘤的生长。2.经过12天的ADS-Ⅰ灌胃给药,胃癌N87细胞裸鼠移植瘤的重量显著小于对照组。3.Western blot检测结果显示,ADS-Ⅰ显著抑制了胃癌N87细胞裸鼠移植瘤内p-JAK1、p-JAK2及p-STAT3蛋白的表达,阻断了JAK/STAT3信号通路。4.Western blot检测结果显示,ADS-Ⅰ显著抑制了胃癌N87细胞裸鼠移植瘤内Ki67、Bcl-2、MMP-9、Snail及Twist蛋白的表达。结论1、ADS-Ⅰ能够显著抑制胃癌细胞的增殖、侵袭、迁移及上皮间质转化。2、ADS-Ⅰ可能通过调控JAK/STAT3信号通路的活性来调控胃癌细胞的增殖、侵袭、迁移及细胞上皮间质转化等恶性生物学行为。3、ADS-Ⅰ能够抑制胃癌裸鼠移植瘤的生长,并阻断移植瘤中JAK/STAT3信号通路。