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乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个全球性的公共卫生问题。HBV感染可以引起急性或慢性肝炎,严重者能够导致发生肝硬化甚至肝癌。HBV感染宿主后,HBV共价闭合环状DNA(HBV ccc DNA)可整合入宿主细胞的染色体中,并能够在宿主细胞中复制,可形成慢性持续性感染状态。对于HBV的治疗,虽然临床上应用干扰素α和核苷类似物治疗HBV感染,能够一定程度上抑制病毒复制,但是由于病毒突变和HBV ccc DNA的存在,这些药物不能产生持续的抗病毒免疫应答,不能够彻底清除肝细胞内的乙肝病毒。抑制宿主体内HBV病毒复制,降低其致病性,需要深入分析HBV-宿主的之间的相互作用,研究病毒复制调控的机制。近年来的研究表明,micro RNA(miRNA)是病毒与宿主相互作用的一类新的调控分子,在病毒的复制及致病中发挥重要的作用。深入研究miRNA在HBV复制及致病中的作用,有利于进一步阐明HBV与宿主的相互作用,并为发展新型的抗HBV药物提供新的靶点和策略。为了探索HBV复制相关的miRNA,我们首先利用不同HBV复制表达水平的细胞系,通过生物芯片分析,筛选可能与HBV复制相关的miRNA。然后通过研究miRNA与HBV复制之间的相互关系及分子机制,阐明miRNA在HBV-宿主相互关系中的作用。1.miR-15b对HBV复制与表达的影响研究(1)HBV复制相关miRNA的筛选及鉴定为了探索HBV复制相关的miRNA,我们用Hep G2细胞系、Hep G2.2.15细胞系、Hep Ad38细胞系分别作为无HBV复制细胞模型、HBV低复制细胞模型、HBV高复制细胞模型,通过miRNA生物芯片分析这三种细胞系中miRNA表达水平的变化,选择6个随病毒复制表达增加而逐渐降低的miRNA,作为可能与HBV复制相关的候选miRNA。然后将miRNA模拟物转染入瞬时表达HBV的细胞中,通过检测HBe Ag表达水平的变化,筛选HBV复制相关的miRNA,结果表明:仅有miR-15b能够促进HBe Ag的表达,其他miRNA对HBe Ag表达无显著影响。因此我们选择miR-15b作为研究对象,研究其在HBV复制中的作用及分子机制。(2)miR-15b对HBV复制与表达的影响我们通过在胞外分泌的HBe Ag、HBs Ag、HBV DNA以及胞内HBV RNA、HBV复制中间体等水平检测miR-15b对HBV复制及蛋白表达的影响。在HBV瞬时表达的Huh7细胞以及HBV稳定表达的Hep G2.2.15细胞中,miR-15b过表达能够促进HBV的复制与表达;抑制内源性miR-15b的表达能够降低HBV的复制与表达。为了在体内水平检测miR-15b对HBV复制的影响,我们使用重组8型腺相关病毒载体介导的乙型肝炎病毒持续感染小鼠模型,通过高压水动力法将miR-15b抑制性载体注射入小鼠体内,检测HBV DNA,结果显示:抑制内源性miR-15b的表达后小鼠血清中HBV DNA拷贝数降低。上述结果说明:miR-15b可以促进HBV的复制与表达。2.miR-15b调节HBV复制与表达的分子机制研究(1)研究miR-15b调控HBV复制与表达是否通过直接靶向HBV转录产物而实现miRNA可能通过直接靶向HBV转录产物或者靶向HBV转录和复制过程中重要的调控因子这两种方式调控HBV的复制与表达。首先通过生物信息学分析miR-15b是否能够直接靶向HBV基因组,结果发现在HBV基因组上存在一个miR-15b可能的靶位点(417 nt-423 nt),将含此位点的序列构建入miRNA靶基因鉴定的报告基因载体中,与miR-15b mimics共转染细胞,报告基因结果显示:miR-15b并不影响报告基因活性,即miR-15b不能通过直接靶向HBV转录产物而影响病毒的复制。(2)研究miR-15b调控HBV复制与表达是否通过靶向HBV复制调控相关因子而实现排除了miR-15b通过直接靶向HBV转录产物影响病毒复制的可能性,分析miR-15b可能通过靶向病毒复制相关的因子影响病毒复制。HBV复制过程中ccc DNA合成以及以ccc DNA为模板进行的基因转录是病毒复制的重要调控环节。HBV转录过程中启动子与增强子等调控元件以及转录因子发挥了重要的调控作用。排除了miR-15b直接靶向HBV转录产物的可能性,推测miR-15b可能是通过影响HBV转录和复制过程中转录因子的表达,从而影响启动子或者增强子活性,进而调控HBV的复制与表达。我们分析miR-15b对HBV启动子和增强子的影响。将HBV启动子和增强子基因建入报告基因载体p GL3-Basic中,与miR-15b mimics共同转染细胞,报告基因的结果说明:miR-15b能促进HBV增强子Ⅰ(HBV EnhancerⅠ)的活性,而对其他调控元件不影响。我们推测miR-15b可能靶向调控HBV EnhancerⅠ活性的转录因子,从而影响其活性。生物信息学分析既是miR-15b的靶基因,又可以结合HBV EnhancerⅠ的分子,结果提示:肝细胞核因子1α(HNF1α)可能既是miR-15b靶分子,又是HBV EnhancerⅠ的结合分子,即HNF1α可能是miR-15b促进HBV EnhancerⅠ活性的中介分子。(3)miR-15b靶基因的验证为了检测HNF1α是否为miR-15b的靶基因,我们将HNF1α3’UTR及其靶位点突变的HNF1α3’UTR构建入靶基因鉴定的报告基因载体中,与miR-15b mimics共转染细胞,报告基因结果显示:miR-15b能够降低含有HNF1α3’UTR的报告基因活性,而不能影响靶位点突变的报告基因活性,这说明miR-15b能够直接靶向HNF1α3’UTR。为了进一步研究miR-15b对细胞中HNF1αm RNA及蛋白表达的影响,结果发现miR-15b过表达抑制了HNF1αm RNA以及蛋白表达;而抑制内源性miR-15b则促进了HNF1αm RNA以及蛋白表达。在小鼠体内获得了同样的结果。上述结果表明HNF1α是miR-15b的靶基因。(4)HNF1α对HBV复制与表达的调控作用研究生物信息学预测表明HBV EnhancerⅠ含有HNF1α结合位点,为了进一步验证生物信息学的预测分析结果,我们将HBV EnhancerⅠ及其靶位点突变的HBV EnhancerⅠ构建入报告基因载体p GL3-Basic中,与HNF1α表达载体共转染入细胞,报告基因结果显示:HNF1α能够降低HBV EnhancerⅠ的报告基因活性,而不能影响靶位点突变的报告基因活性,这说明HNF1α能够直接靶向HBV EnhancerⅠ。进一步研究HNF1α对HBV复制及表达的影响,结果发现在细胞中过表达HNF1α可以抑制HBV复制及蛋白表达;而抑制内源性HNF1α表达则可以促进HBV复制及蛋白表达。以上结果说明HNF1α能够直接靶向HBV EnhancerⅠ,通过抑制HBV EnhancerⅠ活性抑制HBV的复制和基因表达。(5)HNF1α是miR-15b促进HBV复制与表达的中介分子上述实验的结果表明HNF1α是miR-15b的靶基因,并且HNF1α能够通过直接抑制HBV EnhancerⅠ活性来抑制HBV复制和基因表达,据此推测miR-15b可能直接靶向抑制HNF1α从而促进HBV EnhancerⅠ的活性,最终促进HBV复制与表达。为了验证我们的猜想,我们利用双报告基因系统研究了HNF1α在miR-15b促进EnhancerⅠ活性中所起的作用,报告基因的结果表明,miR-15b促进了HBV EnhancerⅠ的报告基因活性,但是外源加入HNF1α后,抵消了miR-15b对EnhancerⅠ的促进作用。同样的,在HBV瞬时表达的Huh7细胞中,miR-15b能够促进HBe Ag、HBs Ag的表达,但是外源加入HNF1α后则抵消了miR-15b对HBV抗原表达的促进作用。以上结果表明,HNF1α是miR-15b促进HBV Enhancer I活性以及促进HBV复制表达的中介分子。3.HBV感染宿主细胞对miR-15b表达的影响研究在前期的芯片结果及实验中,我们发现随着HBV复制水平的升高,miR-15b表达逐渐降低。为了检测HBV是否调控miR-15b的表达,我们在细胞和动物水平分别检测HBV的复制与表达对miR-15b表达的影响,发现HBV能够抑制miR-15b的表达。进一步研究HBV编码蛋白对miR-15b表达的影响,在瞬时表达HBV编码蛋白的细胞中,发现HBV编码的HBx蛋白能够抑制miR-15b表达,而其他HBV编码蛋白不影响miR-15b表达。检测miR-15b在HBx转基因小鼠肝脏中表达的动态变化,发现HBx转基因小鼠中miR-15b的表达随时间进展逐渐降低。以上结果说明:HBV病毒的X蛋白抑制宿主细胞的miR-15b表达。我们的研究说明:miR-15b能够通过直接靶向HBV EnhancerⅠ的负调控因子HNF1α从而促进了HBV EnhancerⅠ的活性,最终促进了HBV的复制与表达;另一方面,HBV特别是HBx的表达,能够使细胞内miR-15b的表达水平降低。HBV与miR-15b之间存在着负反馈调控作用。HBV通过负调控其复制促进因子miR-15b,负反馈调节自身复制,从而避免复制失控而被免疫系统识别。miR-15b与HBV之间互相调节在控制HBV复制、维持HBV的持续感染中发挥重要作用。