中东呼吸综合征冠状病毒MERS-CoV (Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus)是一种新发的高致病性冠状病毒,感染之后能够引起严重的呼吸系统疾病,有时还伴有肾衰竭。截止到2015年6月6号,全球共确诊了1190个病例,其中444例死亡,病死率接近40%。虽然目前还没有确切的实验室证据表明该病毒能够在人际间传播,但是动物检测研究结果、流行病学研究和基因组分析提示该病毒有很大的可能性能够在人际间传播且存在大暴发的可能。目前尚无针对该病毒的疫苗和特异性抗病毒药物,了解其致病和免疫保护或逃逸机制对于发现抗该病毒的药物靶标有着重要的理论意义。干扰素及其诱导的细胞抗病毒免疫反应是宿主抵抗病毒入侵的第一道防线,在病毒感染早期发挥着非常重要的抗病毒作用,而病毒在其感染过程中也能够通过其自身编码的病毒蛋白抑制宿主的天然免疫反应而发生天然免疫逃逸；细胞自噬是真核生物中广泛存在的一种溶酶体依赖性的降解途径,不同病毒可通过其编码蛋白诱导或者抑制宿主细胞自噬的发生来发挥重要的抗病毒和促病毒作用。研究表明,MERS-CoV感染之后并不能诱导机体产生强的Ⅰ/Ⅲ型干扰素IFN (Interferon)和促炎症细胞因子反应,提示MERS-CoV能有效的抑制宿主的天然免疫反应。虽然目前自噬与冠状病毒复制之间的关系还不明确,但是冠状病毒及其多个编码蛋白确实能够诱导细胞自噬。明确MERS-CoV病毒蛋白与天然免疫和细胞自噬之间的关系能够为我们进一步明确该病毒的致病和免疫逃逸机制和发现新型抗病毒药物靶标提供理论依据和新思路。鉴于此,本研究对中东呼吸综合征冠状病毒结构蛋白和附属蛋白拮抗干扰素和诱导自噬的机制进行了研究,结果如下：1、MERS-CoV结构蛋白和附属蛋白ORF3、ORF4a、ORF4b、ORF5的表达和亚细胞定位根据NCBI上发表的序列我们合成了相关基因,成功构建了带N端]HA-tag的MERS-CoV结构蛋白和附属蛋白的真核表达质粒,并通过WB和IFA对表达进行了验证。同时通过Confocal实验我们初步确定了MERS-CoV结构蛋白和附属蛋白的的亚细胞定位。结构蛋白S呈典型的分泌途径分布,从内质网到细胞膜；E蛋白和M蛋白主要定位于高尔基体；N蛋白弥散分布于细胞质内。附属蛋白ORF3在细胞质内呈点状分布,与内质网、内质网高尔基复合体有共定位；ORF4a弥散分布在细胞质内；ORF4b主要位于细胞核内,在胞浆内也有弥散分布；ORF5与高尔基体和内质网高尔基复合体共定位。这部分结果为我们下一步的功能研究奠定了基础。2、ORF4a, ORF4b, ORF5以及M蛋白具有拮抗I型干扰素的功能通过双荧光素酶报告基因实验检测IFNβ启动子的激活和半定量RT-PCR检测IFNβ mRNA的转录我们筛选出MERS-CoV的附属蛋白ORF4a、ORF4b、ORF5和结构蛋白M具有拮抗干扰素的活性。这四个蛋白都能抑制蛋白能抑制IRF-3的功能,同时ORF4a还能抑制NF-κB的激活。此外,通过双荧光素酶报告基因实验检测ISRE启动子的激活和半定量RT-PCR检测ISG54和ISG56 mRNA的转录,我们发现ORF4a、ORF4b和M蛋白还能抑制干扰素的信号转导,说明ORF4a、ORF4b和M不但能够抑制干扰素的合成,还能抑制干扰素的信号转导,而ORF5只能抑制干扰素的合成。3、ORF4b在细胞质和细胞核内都能抑制干扰素的诱导,在细胞质内可通过与IKKε和TBK1相互作用发挥功能通过免疫共沉淀和Confocal实验证明ORF4b能够与RIG-I样受体通路蛋白MDA5、 IKKε和TBK1特异性结合。ORF4b与MDA5的N端CARD结构域有更强的相互作用,这种相互作用不影响MDA5与接头蛋白MAVS的结合。ORF4b和IKKε和TBK1的相互作用能够抑制IKKε和TBK1对IRF3的磷酸化。进一步研究发现ORF4b并不能影响IKKε和TBK1与其磷酸化底物IRF3和IRF7的结合,但是能够抑制IKKε与接头蛋白MAVS的相互作用。利用RLR通路蛋白作为干扰素诱导剂,我们发现ORF4b和缺失核定位信号的ORF4b (△2-38)都能抑制过表达RIG-I, MDA5, MAVS, IKKε, TBK1所诱导的I型干扰素反应,不同的是ORF4b能够抑制过表达IRF3所诱导的I型干扰素反应,而ORF4b(△2-38)则不能,说明ORF4b在细胞质内和细胞核内以不同的机制抑制干扰素的诱导产生。4、E蛋白和M蛋白能够诱导宿主细胞发生不完全自噬,且不依赖mTOR通路通过激光共聚焦观察LC3点状聚集、透射电镜观察自噬体样结构和Western-blot检测LC3-Ⅱ的表达水平确认了MERS-CoV结构蛋白E和M能够诱导细胞自噬。通过WB检测自噬性底物p62的表达水平、LC3 turnover实验、mRFP-GFP-LC3所代表的细胞自噬流(Autophagic flux)以及GFP-LC3与溶酶体标记蛋白LAMP1的共定位情况证明E蛋白和M蛋白能够抑制自噬体与溶酶体的融合诱导不完全自噬。通过WB检测4E-BP1和S6K蛋白的磷酸化水平,我们发现E和M蛋白不激活nTOR/4E-BP1和mTOR/S6K通路。通过检测XBP1基因的剪切、ATF6蛋白的切割和ATF4蛋白的表达水平,我们发现E和M蛋白能够激活UPR的IRE1-XBP1通路。总之,本研究发现MERS-CoV附属蛋白ORF4a、ORF4b、ORF5和结构蛋白M具有拮抗干扰素的活性。其中,ORF4b除了在细胞质可通过与IKKε和TBK1相互作用拮抗I型IFN产生外,在细胞核内还可能通过未知机制抑制干扰素的合成。MERS-CoVE蛋白和M蛋白能够抑制自噬体和溶酶体的融合诱导不完全自噬。以上结果为进一步丰富我们对MERS-CoV致病和免疫机制的了解,发现新型抗MERS-Cov药物的靶标提供了新的理论依据。