灰霉菌(Botrytis cinerea Pers.:Fr.)又称为灰葡萄孢,是葡萄孢属真菌中最大类群的复合种,也是该属真菌的模式种。灰霉菌寄主非常广泛,可引起200多种植物发生灰霉病害(Gray Mould)。由于该菌具有广寄主和低温致病特性,因此也是引起葡萄、草莓,番茄等多种水果和蔬菜采后病害的重要病原。我们实验室在前期的研究中发现,葡萄果实在低温贮藏过程中会发生两类不同致病症状的灰霉病,通过寄主和体外的发育和致病表型分析,发现了一类与经典分类学意义上描述的模式菌株产孢差异显著的新类群,由于此类群产孢迅速,极具传播和危害性,深入研究该类群的形态与发育特征,将会为丰富灰葡萄孢复合种种级以下的分类单元提供依据。本研究以灰霉菌新类群的典型代表菌株GBot-0023和模式类群代表菌株B05.10为实验材料,分别采用光学显微技术和电子显微技术比较研究了新类群与模式类群之间的形态和发育过程差异;从营养利用角度分析了两种类群产孢存在差异的原因,并应用透射电子显微技术从超微结构比较了环境光因子对两类群菌丝和孢子的影响差异,为今后制定控制措施提供依据。主要研究结果如下:1.扫描电镜的观察结果显示新类群GBot-0023与模式菌株B05.10在孢子的类型、表面纹饰、大小上有明显的差异。B05.10可以产生大量的小孢子,大型分生孢子较大,表面纹饰较浅;而GBot-0023主要产生大型分生孢子,较小,表面纹饰较深;透射电镜的观察结果显示,GBot-0023与B05.10菌丝的超微结构没有明显差异,而孢子的内部结构明显不同。B05.10孢子细胞质的大部分体积被贮藏体占据,少有线粒体等其他细胞器;而GBot-0023孢子中可见体积很小的多个贮藏体及大量线粒体。GBot-0023和B05.10的孢子表面纹饰和超微结构存在巨大差异,且结果稳定,可以作为灰霉菌种内划分的参考依据。2.应用光学显微镜对两种类群灰霉菌的发育过程进行观察发现,GBot-0023与B05.10相比发育过程相同,但在各个发育器官产生的时间上差异显著。B05.10触附器的产生明显滞后于GBot-0023,可能是其产孢较慢的重要原因之一;进一步探讨促进B05.10产孢的条件时发现,低糖(0.5%葡萄糖)可加快B05.10触附器分化,进而加速B05.10产孢。而高糖(5%葡萄糖)对B05.10产孢细胞上生长出孢子这一过程有一定的抑制作用。表明灰霉菌触附器的分化时间是两类群存在产孢差异的关键点。3.GBot-0023与B05.10相比可在多种培养基和低温下迅速并大量产孢,对营养和温度变化适应力极强。在PDA培养基25℃条件培养下GBot-0023菌丝为墨绿色,培养第3天大量产孢,菌落生长没有明显的节律性。而B05.10的菌丝灰白色,蓬松茂密,产孢滞后,菌落生长存在节律性。在葡萄糖、番茄和葡萄汁以及MY等不同营养条件培养下B05.10菌落形态变化显著,且需要特殊的营养条件才可促进其产孢;而GBot-0023菌落生长与形态没有明显差别,均可快速、大量的产孢。在4℃低温条件下培养45天B05.10菌落表面可形成大量菌核,不产分生孢子,而GBot-0023在低温下产孢正常,培养3个月仍无菌核产生。GBot-0023和B05.10对光的感应存在相似性。其中蓝光可以抑制二者的产孢和色素形成。4.不同光质及光照时间对GBot-0023与B05.10菌丝的超微结构影响不同。蓝光照射B05.10 24h后,线粒体膨大变形,嵴呈空泡状变形;随着光照时间的延长(72h),线粒体有恢复的现象。而蓝光照射可引起GBot-0023菌丝的线粒体出现同心涡旋状变形,且随着光照时间的延长(72h),线粒体没有恢复的趋势。不同光质及光照时间对GBot-0023与B05.10的孢子没有明显的影响。综上所述,两类群灰霉菌在菌落形态、孢子形态、产孢量、生长发育的进程及对营养的利用、对温度的感应等方面均有很大的差异。触附器的形成时间是两类群菌产孢存在差异的关键点。新类群代表菌株GBot-0023对环境的适应性和抗逆性强,需引起更多的关注和重视。蓝光不仅可以抑制经典模式灰霉菌B05.10的产孢,还可以抑制大量产孢类群代表菌株GBot-0023的产孢,并引起菌丝中的线粒体结构发生异常。建议作为控制灰霉菌的一种物理措施进一步深入研究。本研究结果不仅为丰富灰霉菌种级以下的分类单元提供了可视化的分类依据,也为今后合理应用光源防控果蔬采后灰霉病的发生提供了重要的依据。病原菌侵染是造成新鲜水果和蔬菜采后腐烂的主要原因,给我国经济带来巨大的损失。柿子是上海果品市场销售的主要水果之一,由于其口感香甜,营养丰富,深受广大消费者的青睐。然而近3年的调查发现,表面看似健康的市售柿子其果肉内部却常常出现大量颗粒状或块状黑色物质,由于此类症状发生在果皮之下,从外观上很难察觉,易造成消费者误食,严重影响到柿子的食用安全和销售货架期。前人对柿子病害的研究主要集中在采收前的栽培期,对其采收后在市场销售中的病害则少有报道。本研究在对上海市柿子零售和批发市场进行销售情况和市场病害发生状况调查的基础上,重点针对严重影响柿子销售货架期的柿果黑腐病害进行病原物的分离鉴定,探索其形成的原因,以期为确保柿子的安全供应,控制此类病害的发生提供重要依据。研究结果表明:1.上海水果市场销售的柿子主要来自于广西桂林、江苏东台、广东、山西和浙江杭州等地,其中以广西桂林为最主要的来源地。市售的柿子病害发生率高达85.52%,来源于各产地的柿子均存在病害症状。根据病症将其分为两类:果肉颗粒状黑腐病和果顶黑腐病。果肉颗粒状黑腐病占病害总数的60.94%,果顶黑腐病占24.58%。在取样调查期间,来源于桂林、山西和广东的柿子主要发生果肉颗粒状黑腐病,其中桂林和山西的柿子发病率为100%,广东的柿子发病率为87.5%;江苏东台和浙江杭州的柿子主要发生果顶黑腐病。江苏东台的柿子2010年发病率为16.67%,2011年为80%,呈显著增加的趋势;浙江杭州的柿子发病率为100%。2.扫描电镜观察病害组织的超微结构,结果显示果肉黑腐颗粒严重木栓化,部分颗粒中可见菌丝,果顶黑腐组织中同样存在大量菌丝。对病害组织进行病原菌分离的结果显示,三年间不同产地柿子中黑腐颗粒的平均带菌率达到29.82%,其中2010年来源于桂林的柿子果肉中的黑腐颗粒带菌率为66.67%,2011年为58.89%,2012年为5.56%;山西的柿子带菌率较低,为8.89%;广东的柿子带菌率为9.50%,而果顶黑腐组织全部带菌。从柿子病害组织中分离得到多种细菌和真菌。真菌分别为枝孢属(Cladosporium spp.)、链格孢属(Alternaria spp.)、青霉属(Penicillium spp.)、镰刀菌属(Fusarium spp.)、炭疽菌属(Colletotrichum spp.)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis sp.)、葡萄孢属(Botrytis sp.)及其他未知真菌。各批次柿子中的果肉黑腐颗粒均能分离出芽枝霉,且检出率较高。果顶黑腐组织中主要检出链格孢属和枝孢属真菌,其中链格孢属真菌的检出率最高。3.依据柯赫氏法则分离出导致柿子果顶黑腐病的强致病性真菌Alt-2,进一步应用形态学和真菌rDNA-ITS序列分析及多聚半乳糖醛酸酶基因序列分析,确定该菌为细极链格孢菌(Alternaria tenuissima);应用形态学及rDNA-ITS序列分析确定导致果肉颗粒状黑腐病的主要病原菌为芽枝霉属真菌(Cladosporium spp.)。