氨肽酶（Aminopeptidase,AP,EC 3.4.11）是一类外切蛋白酶,能够特异性降解多肽链和蛋白质N末端疏水性氨基酸残基,释放出游离氨基酸。氨肽酶能够有效降低蛋白水解液的苦味,改善食品风味,提高营养价值。它与碱性蛋白酶等内切酶协同作用,可以促进蛋白质的深度水解,应用于多种活性肽的制备。本研究筛选到了一株产氨肽酶地衣芽孢杆菌,并克隆其编码基因,在Escherichia coli BL21和Bacillus subtilis 168中高效表达,研究了重组酶的酶学性质,及其与碱性蛋白酶协同作用高效水解大豆分离蛋白和酪蛋白,产生小分子活性肽和游离氨基酸。具体研究内容包括:（1）产氨肽酶菌株的筛选鉴定及基因克隆。利用酪蛋白平板水解透明圈法和酶活测定方法相结合,从土壤中筛选到一株产氨肽酶菌株。通过对菌株的形态和生理生化特性进行分析,以及16S r DNA测序结果比对,鉴定该产氨肽酶菌株为地衣芽孢杆菌,命名为Bacillus licheniformis E7。利用染色体步移技术从B.licheniformis E7基因组DNA中克隆出完整的氨肽酶基因pep N,全长为1,446 bp,编码481个氨基酸。（2）重组菌E.coli BL21/p ET28-pep N和B.subtilis 168/p MA0911-pep N构建与重组蛋白的表达。以p ET-28a（+）和p MA0911为表达载体,以E.coli BL21（DE3）和B.subtilis 168为表达宿主,构建重组氨肽酶表达菌株E.coli BL21/p ET28-pep N和B.subtilis 168/p MA0911-pep N。SDS-PAGE结果表明重组氨肽酶在E.coli BL21胞内表达（命名为Ec Pep N）,在B.subtilis 168胞外和胞内表达(命名为Bs Pep Nex和Bs Pep Nin),分子量约52 k Da,与理论值相符。Ec Pep N在0.1 m M IPTG和20℃诱导条件下表达最好,Bs Pep Nex和Bs Pep Nin在30℃诱导条件下表达最佳。（3）重组氨肽酶的纯化及酶学性质分析。利用镍离子亲和层析法纯化重组酶,经100 m M咪唑洗脱获得目的蛋白,SDS-PAGE分析表明纯化的重组酶在52 k Da左右显示为单一条带。酶学性质研究结果显示,三种酶的最适反应条件分别为:Ec Pep N为p H 9.0、50℃,Bs Pep Nex为p H 9.0、45℃,Bs Pep Nin为p H 7.0、45℃,Ec Pep N、Bs Pep Nex和Bs Pep Nin最高比酶活分别为365.04、401.33和113.77 U·mg-1。它们在p H 6.0-9.0范围内较稳定,在45℃条件下的半衰期分别为36 h、6 h和12 h。Ec Pep N表现出最佳的耐盐性,在3 M Na Cl溶液中孵育22天后,酶活力高于55%。以7种底物进行酶活测试,Ec Pep N、Bs Pep Nex和Bs Pep Nin对底物Ala-p NA比酶活最高,是一种丙氨酸氨肽酶,它们对底物Ala-p NA的Km值分别为1.20、1.01和1.09 m M,Ec Pep N和Bs Pep Nex的kcat/Km值大约是Bs Pep Nin的4倍。（4）重组氨肽酶与碱性蛋白酶协同水解大豆分离蛋白和酪蛋白的产物谱分析。以商品化氨肽酶为对照,重组氨肽酶与商品化碱性蛋白酶协同催化大豆分离蛋白的水解液中,75%以上为分子量小于500 Da的多肽,2,000 mg·L-1以上的多种游离氨基酸,其总量是碱性蛋白酶单独催化的50倍以上。双酶协同水解酪蛋白的水解液中,小于500 Da的多肽占78%左右,其中小于150 Da的小肽含量是碱性蛋白酶单酶水解时的6倍。不同表达形式的重组氨肽酶Pep N的蛋白水解效果差别不大,且与商品化亮氨酸氨肽酶的蛋白水解效率相当。该研究为提高富含蛋白质生物资源的增值和蛋白质的深度水解提供了重要研究途径。