目的:Ⅰ型变态反应疾病是一类由IgE介导的过敏性疾病,主要包括支气管哮喘,鼻炎,结膜炎等疾病。主要表现为大量表达Th2细胞因子、嗜酸粒细胞和肥大细胞浸润,同时引发炎性反应。近年来Ⅰ型变态反应性疾病的发病率明显升高,其受重视程度日益增强。Ⅰ型变态反应疾病是一种需要从多角度多层面综合性治疗的疾病,而现阶段对其尚没有完善治疗方法,它已成为一个全球性健康问题。近期大量研究发现肥大细胞在Ⅰ型变态反应性炎症发病机制的过程中贯穿始终,起核心作用。肥大细胞是速发型过敏反应的初级效应细胞,其激活直接影响次级效应细胞—嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的募集和激活,是重要的调节性免疫细胞,是介导速发型过敏和炎症的重要枢纽,能引发和扩大炎症反应。同时,肥大细胞还参与了许多疾病和炎症过程,特别是与一些变态反应性疾病如荨麻疹、银屑病和系统性红斑狼疮的发生关系密切。但是对于肥大细胞活化的确切机制尚不清楚,调控肥大细胞活化的药物也寥寥无几,如果能够深入探明肥大细胞在Ⅰ型变态反应中作用机以及干预靶点,寻找有效干预其活化的临床治疗方案,将有利于进一步完善过敏性哮喘等相关疾病的防治策略。近年来发现氢分子作为一种新兴的气体信号分子,具有干预多种炎症反应(如急性胰腺炎、急性肺炎等)以及免疫调节作用,因此本研究以小鼠肥大细胞P815为研究对象,建立肥大细胞活化模型,从干预肥大细胞活化的角度探索氢气饱和灭菌水治疗Ⅰ型变态反应性疾病的潜在机制及靶点,为治疗Ⅰ型变态反应疾病提供新的思路。方法:肥大细胞(P815小鼠肥大细胞株,购买来自美国)在1640培养基中进行培养,其中含有10%新生小牛血清,实验设计分组:正常空白对照组(Con组)、Anti-DNP-IgE模型组(Anti-DNP-IgE组)、氢气饱和灭菌水治疗组(Anti-DNP-IgE+H2组)、单纯氢气饱和灭菌水组(H2组)。通过MTT实验确定了Anti-DNP-IgE的最适宜浓度及干预时间。通过对各组进行甲苯胺蓝染色从形态学角度揭示氢气饱和灭菌水对于Anti-DNP-IgE诱导肥大细胞活化是否影响,初步观察氢气饱和灭菌水对Anti-DNP-IgE诱导肥大细胞活化的影响;通过ELISA试剂盒检测肥大细胞活化的关键性的指标包括组胺(HIS),β氨基己糖苷酶(β-Hex)以及类胰蛋白酶(TPS)在各组中水平从免疫调节角度验证氢气饱和灭菌水对于Anti-DNP-IgE诱导肥大细胞活化究竟有何种影响;从形态学角度应用免疫荧光染色技术进一步研究氢气饱和灭菌水干预肥大细胞活化机制的三种关键酪氨酸蛋白激酶(Lyn、Syk、Fyn)与受体(Fce RIβ)结合情况。进一步从分子角度探讨氢气饱和灭菌水调控肥大细胞活化的分子机制,Western Blot方法观察氢气饱和灭菌水是否干预肥大细胞活化机制的初始阶段三种关键酪氨酸蛋白激酶(Lyn、Syk、Fyn)以及下游通路PI3K-AKT分子信号转导通路的表达。结果:1 Anti-DNP-IgE激活肥大细胞的最适干预时间和浓度。通过MTT实验确定Anti-DNP-IgE激活肥大细胞的最适宜浓度及干预时间分别为1000ng/ml、10h。2肥大细胞活化的甲苯胺蓝染色形态学观察。正常对照与单纯氢气饱和灭菌水组无明显改变,Anti-DNP-IgE模型组细胞质内分泌囊泡明显增多,而氢气饱和灭菌水治疗组内细胞质内囊泡明显减少。从形态学角度初步证明了氢气饱和灭菌水对肥大细胞活化是有影响的。3氢气饱和灭菌水抑制了Anti-DNP-IgE诱导的肥大细胞活化。本课题选用肥大细胞活化三个关键指标(组胺、β氨基己糖苷酶以及类胰蛋白酶),提取各组细胞上清液,通过ELISA实验检测各组细胞组胺、β氨基己糖苷酶以及类胰蛋白酶的ELISA水平检测:Anti-DNP-IgE模型组中的组胺、β氨基己糖苷酶以及类胰蛋白酶水平相比正常对照组明显升高,而氢气饱和灭菌水治疗相比Anti-DNP-IgE模型组有明显降低。说明氢气饱和灭菌水对于肥大细胞活化指标具有明显的抑制作用。4形态学角度观察氢气饱和灭菌水对肥大细胞活化的三种关键酪氨酸蛋白激酶影响。免疫荧光双重定位染色结果显示:Anti-DNP-IgE刺激后,发现Syk、Lyn以及Fyn三种蛋白会发生在细胞内的重新分布,均会向细胞膜上转移;而经氢气干预后,会抑制上述转移。进一步从形态学说明氢气饱和灭菌水可能通过抑制三种酪氨酸激酶通路来抑制肥大细胞活化。5氢气饱和灭菌水抑制了肥大细胞活化初始阶段的三种关键酪氨酸蛋白激酶的激活。Western blot结果显示Anti-DNP-IgE刺激后,P-SYK、P-LYN、P-FYN表达明显增高;而经氢气饱和灭菌水干预后上述指标表达明显减少。说明氢气饱和灭菌水可能抑制三种酪氨酸蛋白激酶的表达,从而达到对肥大细胞活化抑制的作用。6氢气饱和灭菌水抑制肥大细胞活化的下游通路PI3K-AKT分子信号转导通路的激活。Western blot结果显示,相比于Anti-DNP-IgE模型组,氢气饱和灭菌水治疗组的P-PI3K以及P-AKT表达明显减少。说明氢气饱和灭菌水抑制Anti-DNP-IgE刺激后肥大细胞活化,可能是通过抑制肥大细胞活化下游经典通路PI3K-AKT的激活来实现。结论:1氢气饱和灭菌水对Anti-DNP-IgE诱导的肥大细胞活化具有抑制作用。2氢气饱和灭菌水抑制肥大细胞活化初始阶段的三种关键酪氨酸激蛋白酶(Lyn、Syk、Fyn)的膜转移以及磷酸化的过程。3氢气饱和灭菌水抑制肥大细胞活化的下游通路PI3K-AKT分子信号转导通路的激活综上所述,氢气饱和灭菌水抑制了Anti-DNP-IgE诱导的肥大细胞活化,其机制有可能是通过调控肥大细胞活化初始阶段三种酪氨酸激蛋白酶(Lyn、Syk、Fyn)的磷酸化,继而抑制了下游PI3K-AKT信号转导通路的激活而实现的。