研究目的：　　缺血性脑卒中是由于脑组织局部供血动脉血流的突然减少或停止，造成供血区的脑组织缺血，导致脑组织坏死、软化，并伴有相应部位的临床症状和体征，如偏瘫、失语等神经功能缺失的症候。具有高发病率、高死亡率、高致残率、高复发率等特点，已经成为危害人类健康的重大疾病。除早期溶栓外，目前仍缺乏明确有效的治疗脑卒中的药物。因此，深入阐明缺血性脑卒中的病理生理机制，有助于新靶点的发现和新药研发。　　ORM（Orosomucoid）是一种急性期反应蛋白，分子量为37-54kd，高度糖基化（45%），主要在肝脏合成。ORM在人中有两种亚型（ORM1和ORM2），小鼠中有三个亚型（ORM1、ORM2和ORM3），大鼠中仅有一型。ORM具有转运药物、调节免疫、维持毛细血管屏障、调节能量代谢等功能[1-4]。有文献报道，人血清O RM升高与缺血性脑卒中的发生率相关；我们的前期研究发现，正常小鼠脑组织表达ORM蛋白，以ORM2为主[5]；在小鼠缺血性脑卒中MCAO模型中，血清ORM的表达升高，提示O RM可能与缺血性脑卒中有关。　　因此，本研究主要探讨ORM是否参与缺血性脑卒中的发生发展，并从血脑屏障、炎症、氧化应激和凋亡等多个角度初步探索ORM影响缺血性脑卒中的机制，以期为新药研发提供新靶点。　　研究方法：　　电凝法制备缺血性脑卒中（MCAO）模型。采用RT-PCR，检测小鼠缺血半暗带以及对侧脑组织ORM1、ORM2和ORM3三个亚型的表达情况；测量小鼠MCAO后梗死面积，判断外源性ORM以及内源性ORM1（ORM1敲除）对脑卒中的影响；采用伊文思蓝染色，检测ORM对MCAO小鼠血脑屏障通透性的影响；采用免疫印迹，检测ORM对MCAO小鼠半暗带以及OGD处理的脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白ZO-1、occludin和claudin-5、黏附连接蛋白VE-claudin和微囊蛋白caveolin-1表达的影响；采用RT-PCR检测，检测ORM对MC AO小鼠半暗带以及OGD处理的脑微血管内皮细胞炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α表达的影响；采用ELISA，检测ORM对MCAO小鼠半暗带以及OGD处理的脑微血管内皮细胞氧化应激指标MDA和SOD表达的影响；采用TUNEL和ELISA，分别检测ORM对MCAO小鼠半暗带和OGD处理的脑微血管内皮细胞凋亡率、以及凋亡蛋白caspase-3活性的影响。　　研究结果：　　实验一、小鼠MCAO后，缺血区ORM升高，以ORM2升高为主　　采用电凝法制备C57BL/6小鼠缺血性脑卒中（MCAO）模型，RT-PCR检测缺血半暗带以及对侧脑组织ORM1、ORM2和ORM3三个亚型的表达情况。结果显示：对侧脑组织以ORM2表达为主。半暗带区ORM显著增加，以ORM2升高为主，提示ORM2可能是参与缺血性脑卒中发生发展的主要亚型。　　实验二、内源性ORM1敲除不影响小鼠M CAO后脑梗死面积　　ORM2敲除小鼠有助于进一步评估ORM2在缺血性脑卒中的作用，目前正在构建中。由于课题组已有ORM1-/-小鼠，我们评估了内源性ORM1亚型在脑卒中发病的作用。结果表明：和野生型比较，ORM1敲除小鼠MCAO后的梗死面积，无显著改变，提示了ORM1亚型不是影响缺血性脑卒中的重要亚型。　　实验三、外源性ORM降低小鼠MCAO后脑梗死面积　　我们进一步观察外源性给予ORM，是否可以影响脑卒中。结果表明，和对照组比较，MCAO术前0.5h、术后0h和术后1h尾静脉注射ORM，均可显著降低小鼠的梗死面积。　　实验四、ORM调节血脑屏障相关蛋白表达，提高M CAO小鼠血脑屏障功能　　血脑屏障破坏在脑卒中发病中起重要作用，我们观察了ORM对MCAO小鼠血脑屏障的影响。结果表明，和对照组比较，MCAO术后1h尾静脉注射ORM，可以显著降低脑组织伊文思蓝染色，并显著降低半暗带Caveolin-1微囊蛋白的表达，显著增加紧密连接蛋白ZO-1、occludin和claudin-5以及粘附连接蛋白VE-claudin的表达。在OGD处理的脑微血管内皮细胞上，也观察到了类似的结果。　　实验五、ORM降低M CAO后的炎症反应　　炎症与中风的发病也密切相关，我们观察了ORM对MCAO小鼠炎症反应的影响。结果表明，和对照组比较，ORM处理可以显著降低半暗带区IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA水平。同样，ORM也可以显著降低OGD诱导的脑微血管内皮细胞(bEnd.3)IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA水平。　　实验六、ORM改善MCAO造成的氧化应激反应　　氧化应激在缺血性脑卒中的发生、发展及预后方面的重要性已达成共识，我们观察了ORM对MCAO小鼠氧化应激反应的影响。结果表明，和对照组比较，ORM处理可以显著降低半暗带区MDA的含量，SOD酶活性有上升趋势，但是无统计学差异；在OGD处理的脑微血管内皮细胞(bEnd.3)上，ORM可以显著增加SOD酶活性，但是不影响MDA含量。　　实验七、ORM抑制MCAO引起的细胞凋亡　　梗死病灶周围的缺血半暗带神经细胞凋亡，与脑缺血损伤关系密切。我们观察了ORM对MCAO小鼠半暗带组织凋亡的影响。TUNEL结果表明，和对照组比较，ORM处理可以显著降低半暗带区细胞凋亡数量；Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，ORM也显著降低半暗带Caspase-3的活性；在OGD处理的脑微血管内皮细胞(bEnd.3)上，ORM可以显著降低Caspase-3的活性及细胞凋亡率。　　研究结论：　　1.ORM参与缺血性脑卒中的发生发展，ORM2可能是起作用的主要亚型，需要进一步通过ORM2敲除小鼠来验证。　　2.ORM保护缺血性脑卒中，与改善血脑屏障、降低炎症、抑制氧化应激以及减轻凋亡等多环节有关。