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大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)是一种重要的食源性致病菌,感染人类后会引起发热、恶心、呕吐、腹部绞痛和腹泻等症状,严重时甚至会导致出血性腹泻或溶血性尿毒综合征。根据世界卫生组织的研究报道,人们因食用被E.coli O157:H7污染的肉制品、奶制品以及果蔬制品等食物而导致多次疫情爆发,因此建立准确有效的检测方法对于监控和预防E.coli O157:H7引起的食物中毒具有重要意义。杂交链式反应(Hybridization chain reaction,HCR)是一种核酸等温信号放大技术,通过目标链与两条发夹探针交替杂交,在无需酶催化作用下,实现核酸信号放大。HCR因其操作简便、设计灵活,并且可以结合不同的信号输出策略而被广泛应用。本研究基于HCR核酸信号放大技术,结合新型阻断(blocker)引物建立了牛奶中E.coli O157:H7的检测方法,各章内容分述如下:第一章综述了杂交链式反应介导的信号输出策略在检测领域中应用的研究进展。第二章建立了 PCR-HCR双信号放大策略用于牛奶中E.coli O157:H7的检测。该方法以E.coli O157:H7特异性基因fliCh7设计引物,上游blocker引物修饰了氧乙烯乙二醇和单链DNA(single strand,ssDNA)片段,下游引物5,端修饰了生物素(Biotin,Bio)。当发生PCR扩增时能产生ss-dsDNA-Bio产物,然后通过表面修饰有链霉亲和素(Streptavidin,SA)的磁珠(Magnetic beads,MBs)捕获PCR产物,形成ss-dsDNA～Bio+SA～MBs复合物。最后利用ssDNA打开两条发夹探针(H1/H2)引发HCR,获得大量长的dsDNA,加入DNA双链荧光结合染料实现荧光检测。本章通过琼脂糖凝胶电泳和激光共聚焦显微镜成像验证了方法的可行性,并优化了该方法的反应条件,以及测定了方法的灵敏度及特异性。在最优条件下,该方法对纯菌液中E.coli O157:H7的最低检测限(Limit ofdetection,LOD)为 7.2 × 101 CFU/mL,相比于没有经过 HCR 放大的灵敏度提高了 100倍,对牛奶加标样中E.coli O157:H7的最低LOD为7.2 ×102 CFU/mL,且方法特异性良好。第三章建立了 HCR结合聚多巴胺(Polydopamine,PDA)均相检测体系,用于E.coli O157:H7的检测。该方法在第二章blocker引物的基础上设计了发夹状blocker引物,通过PCR扩增能够形成ss-dsDNA产物,并根据ssDNA序列设计的发夹探针用于HCR扩增,实现信号放大。利用PDA对ssDNA和dsDNA吸附作用力的差异以及荧光淬灭的性质,将未参与反应的引物和发夹吸附,以此建立一种均相荧光检测E.colli O157:H7的方法。该章首先利用多巴胺在碱性条件下发生自聚合获得PDA,并与氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)和氧化锌(ZnO)比较,验证了 PDA具有较强的抗干扰性,并优化了 PDA反应浓度、HCR反应时间等重要参数,以及评价了方法的灵敏度及特异性。在最优条件下,该方法对纯菌液中E.coli O157:H7的LOD为7.2 × 102CFU/mL,对牛奶加标样中E.coli O157:H7的LOD为7.2 × 103CFU/mL,且方法的特异性良好。