研究目的目前,临床上各种原发性或继发性肾脏疾病进展至终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)后还无法进行人为逆转。肾小管间质纤维化是ESRD进展的决定性因素之一。本研究主要探讨,在马兜铃酸诱导肾脏纤维化之后,氨基端乙酰化丝氨酰-门冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸多肽(N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline,AcSDKP)能否减少已经形成的肾小管间质纤维化,及其主要机制。研究方法第一部分:本研究首先建立小鼠马兜铃酸肾病肾小管间质纤维化自身对照实验模型。C57BL/6小鼠在接受单次肾切除术后,给予5天5mg/kg/day的马兜铃酸(aristolochic acid,AA)腹腔注射。通过深度测序检测马兜铃酸(AA)组和自身对照组肾脏标本中mi RNA和m RNA的全基因组表达谱的变化。部分显著差异表达mi RNA(Defferently expressed mi RNA,DE mi RNA)和m RNA(Defferent expressed m RNA,DE m RNA)经实时RT-PCR验证。利用Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)软件对差异表达DE m RNA的细胞功能和富集信号通路进行分析。第二部分:建立马兜铃酸急性肾病小鼠模型。AA组与AA+AcSDKP组C57BL/6小鼠腹腔注射马兜铃酸(AA)(10 mg/kg/day)5天后,对照组同期腹腔注射生理盐水。第6天,AA+AcSDKP组多肽AcSDKP腹腔注射15天,AA组与对照组同期进行生理盐水腹腔注射。HE染色法和马松(Masson)染色法分别检测肾脏组织损伤与纤维化的改变。对小鼠的血清肌酐、血尿素(Blood Urea Nitrogen,BUN)与尿微量白蛋白进行生化检测。实时荧光RT-PCR检测小鼠肾脏促纤维化因子的基因Serpine1(plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1)蛋白的基因)、extracellular matrix degradation inhibitory factor-1(TIMP-1)、extracellular matrix degradation inhibitory factor-3(TIMP-3)、interleukin-11(IL-11)与transforming growth factor beta 1(TGFβ1)的m RNA水平变化。Western blot检测小鼠肾脏以及小鼠肾脏原代成纤维细胞体外培养的细胞与细胞培养上清中的PAI-1蛋白水平。免疫组化检测肌成纤维细胞标志物Alpha-smooth muscle actin(α-SMA)蛋白以及免疫细胞标志物inducible nitric oxide synthase(i NOS)(巨噬细胞/单核细胞标志物)、Leukocyte differentiation antigen 4(CD4)(T Helper淋巴细胞标志物)与Leukocyte differentiation antigen 8(CD8)(细胞毒性T淋巴细胞标志物)。免疫荧光法分别检测凋亡相关蛋白Fas、Bax以及bcl-2与肌成纤维细胞标志物α-SMA在小鼠肾脏中共表达的变化。第三部分:建立马兜铃酸慢性肾病小鼠模型。AA组与AA+Ac SDK组的C57BL/6小鼠腹腔注射马兜铃酸(5 mg/kg/day)4星期,对照组腹腔注射生理盐水。休息16周后,AA+AcSDKP组给予多肽AcSDKP腹腔注射4星期,AA组与对照组同期给予生理盐水腹腔注射。HE染色法和马松(Masson)染色法检测肾脏组织病理学与纤维化的改变。小鼠的血清肌酐与尿素以及与尿微量白蛋白进行生化检测。实时荧光RT-PCR检测小鼠肾脏促纤维化因基因Serpine1(PAI-1蛋白基因)、TIMP-1、TIMP-3、IL-11与TGFβ1的m RNA表达水平变化。Western blot检测小鼠肾脏的PAI-1蛋白水平。免疫组化检测肌成纤维细胞标志物α-SMA蛋白以及免疫细胞标志物i NOS(巨噬细胞/单核细胞标志物)、CD4(T Helper淋巴细胞标志物)与CD8(细胞毒性T淋巴细胞标志物)。免疫荧光法分别检测凋亡相关蛋白Fas、Bax以及bcl-2与肌成纤维细胞标志物α-SMA在小鼠肾脏中共表达的变化。结果第一部分:马兜铃酸诱导的小鼠肾小管间质纤维化模型中肾脏mi RNA与m RNA表达谱的改变HE染色法和马松(Masson)染色法结果显示马兜铃酸诱导小鼠肾脏组织损伤和肾小管间质纤维化。AA治疗组和自身对照组mi RNA与m RNA的全基因组表达谱发生显著改变,分别有82个显著差异表达的DE mi RNA和4605个显著差异表达的DE m RNA,部分经实时荧光RT-PCR验证。其中,促纤维化的mi R-21家族、mi R-433家族和mi R-132家族显著升高;而抗纤维化的mi R-122-5p和let-7a-1-3p明显降低。本研究使用GO与KEGG软件分析细胞功能和DE m RNA富集的通路。本研究还分析发现了767对反向调控的DE mi RNA与其DE m RNA靶点,并构建上述DE m RNA靶点富集的KEGG信号通路相关的DE mi RNA-DE m RNA反向调控网络。此外,差异表达的DE m RNA分析提示TIMP-1与PAI-1可能是细胞外基质降解的关键抑制因子,为后续研究提供了一部分新的思路与研究对象。第二部分:多肽AcSDKP减少小鼠马兜铃酸急性肾病中已经形成的肾小管间质纤维化。在急性马兜铃酸肾病模型中,多肽AcSDKP能够显著减少经已经形成的肾小管间质纤维化、肾小管病变与肾功能受损。与对照组相比较,AA组中小鼠肾脏中细胞外基质降解的抑制因子TIMP-1与PAI-1以及促纤维化因子TGFβ1与IL-11的m RNA水平显著上调,PAI-1蛋白水平显著上调;肌成纤维细胞(α-SMA+)、巨噬/单核细胞(i NOS+)、T Helper淋巴细胞(CD4+)与细胞毒性T淋巴细胞(CD8+)的数量显著升高。马兜铃酸还诱导小鼠肾脏肌成纤维细胞的凋亡抵抗显著增加。与对照组相比,AA组中肌成纤维细胞(α-SMA+)的凋亡抑制蛋白bcl-2显著上调,促凋亡蛋白Fas、Bax以及Bax/bcl-2的比值也显著下调。后续的多肽AcSDKP给药能够显著降低马兜铃酸诱导的上述变化。与AA组相比较,在AA+AcSDKP组中,细胞外基质降解的抑制因子TIMP-1与PAI-1与促纤维化因子IL-11的m RNA水平显著下降,PAI-1的蛋白水平显著下降;在肌成纤维细胞(α-SMA+)中,凋亡抑制蛋白bcl-2显著下降,而促凋亡蛋白Fas、Bax以及Bax/bcl-2的比值均显著上升;肌成纤维细胞(α-SMA+)、巨噬/单核细胞(i NOS+)、T Helper淋巴细胞(CD4+)与细胞毒性T淋巴细胞(CD8+)的数量均显著下降。此外,在体外培养的小鼠肾脏原代成纤维细胞与细胞培养上清中,多肽AcSDKP还能够抑制TGFβ1诱导的PAI-1蛋白的表达上调。第三部分:多肽AcSDKP减少小鼠马兜铃酸慢性肾病中已经形成的肾小管间质纤维化。在马兜铃酸慢性肾病模型中,多肽AcSDKP也能够显著减少马兜铃酸诱导的已经形成的肾小管间质纤维化、肾小管病变与肾功能受损。与对照组相比较,在AA组中,马兜铃酸能够显著增高细胞外基质的降解抑制因子TIMP-1与PAI-1的m RNA水平,促纤维化因子TGFβ1与IL-11的m RNA水平,以及PAI-1蛋白水平;在肌成纤维细胞(α-SMA+)中显著上调凋亡抑制蛋白bcl-2,显著下调促凋亡蛋白Fas、Bax以及Bax/bcl-2的比值;还能够显著增加肌成纤维细胞(α-SMA+)、巨噬细胞/单核细胞(i NOS+)、T Helper淋巴细胞(CD4+)与细胞毒性T淋巴细胞(CD8+)的数量。与AA组相比较,在AA+AcSDKP组中,多肽AcSDKP能够显著降低TIMP-1、PAI-1、TGFβ1与IL-11的m RNA水平,PAI-1蛋白水平;显著降低肌成纤维细胞凋亡抵抗(bcl-2表达下调,Fas、Bax表达上调,Bax/bcl-2比值上升);并且显著下降肌成纤维细胞(α-SMA+)、巨噬细胞/单核细胞(i NOS+)、T Helper淋巴细胞(CD4+)与细胞毒性T淋巴细胞(CD8+)的数量。结论本研究新发现,在马兜铃酸诱导形成纤维化之后,多肽AcSDKP能够显著减少肾小管间质纤维化,并发现:1)马兜铃酸诱急性肾病中肾脏mi RNA与m RNA全基因组表达谱发生显著改变,并提示TIMP-1与PAI-1可能是细胞外基质降解的关键抑制因子;2)在急性与慢性马兜铃酸肾病模型中,多肽AcSDKP能够减少已经诱导形成的肾小管间质纤维化;3)多肽AcSDKP一方面能够显著降低马兜铃酸诱导的肌成纤维细胞与免疫细胞数量的增加,肌成纤维细胞凋亡抵抗的增强,以及促纤维化因子IL-11的m RNA水平的显著上调,从而减少细胞外基质成分的合成;另一方面,还能够显著降低细胞外基质的降解抑制因子PAI-1与TIMP-1的m RNA水平的大幅度上调,从而解除对细胞外基质降解的抑制,促进细胞外基质的降解。