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以花生(Arrachis hypogaea L.)汕油523种子为材料,在实验室前期研究的基础上,对花生种子2s蛋白进行质谱鉴定、组成型分析和胰蛋白酶抑制活性特点进行研究,并分析其在萌发过程中的动员情况。
本文建立了重复性、稳定性高的双向电泳系统,通过质谱分析鉴定了2s蛋白各组分。2s蛋白均属于conglutin家族,2s-5、2s-4主要是Ara h2的各种异构体,2s-3为Ara h6的各种异构体,而2s-2、2s-1可能是Ara h6降解形成的短肽。在天然状态下2s蛋白是复合蛋白,有两种存在形式。它们分别是由多个分子量不同的亚基组成的,且是以Ara h2和Ara h6组合的复合状态的形式存在的。2s蛋白在胶内活性检测中呈现两条明显的胰蛋白酶抑制条带,其中第二条带的抑制活性较第一条带的抑制活性强,揭示了2s蛋白的亚基组合状态对其抑制活性的强弱是有影响的。而在亚基状态下,只有低分子量的2s蛋白才表现出抑制活性。还原剂导致2s蛋白易被降解和抑制活性的降低或完全丧失,表明二硫键对2s蛋白构象和抑制活性的保持具有重要作用。牛胰蛋白酶和重组人胰蛋白酶消化实验进一步提示了二硫键对2s蛋白构象和抑制活性维持的重要性,同时也进一步揭示了2s-2、2s-1可能是通过酶解产生的短肽。
对萌发过程中花生子叶2s蛋白动员情况进行研究表明,2s含量随着种子萌发时间的延长,其含量急剧下降。其中有两个比较关键的时期,一个时期是萌发0~4 d,另一个时期是萌发6~12 d。第一个时期,2s蛋白被迅速动员,尤其是萌发2~4 d,降解速率较大,萌发4d后2s蛋白就几乎被动员完毕。随着花生种子的萌发,2s蛋白被逐渐降解,不管在天然状态还是亚基状态,其胰蛋白酶抑制活性也逐渐被削弱甚至消失,降解产生的新片段也无抑制活性。通过双向电泳分析表明,在花生萌发0-4 d期间,2s-5两个蛋白质点最早被动员,呈现不断下降的态势。2s-4、2s-3各蛋白质点表现出在萌发初期(0~2 d),先有所增加,而后随着种子吸胀的加剧(2~4 d),呈比较明显的下降趋势。低分子量的2s-2两个蛋白质点在此期间变化较小,推测因其具有一定的胰蛋白质抑制活性,对蛋白质酶消化有一定的抑制作用,故在此期间量变化维持稳定。在花生萌发6~12 d期间,2s几乎被动员完毕,产生一些分子量小的新蛋白质点,这些蛋白质点在量上也没有太大的差异。