研究背景阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的脑内病变是一个慢性炎症的观点，已经普遍被人们接受。AD脑内慢性炎症反应的特征包括：与β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)沉积和老年斑(senile plaques，SP)形成有关的小胶质细胞激活，反应性星形胶质细胞增生，以及补体成份和致炎性细胞因子的表达增加等。非甾体类抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)不仅可以降低AD发生的危险性，而且可以延缓AD的进程。动物实验研究证实，NSAIDs可以抑制AD转基因模型小鼠脑内Aβ的沉积和SP的形成，并抑制小胶质细胞活化和反应性星形胶质细胞增生以及IL-1β等致炎性细胞因子的表达与分泌。因此，抗炎治疗AD具有重要的价值。但是，由于NSAIDs严重的毒副作用，可能限制其在临床上的使用。雷公藤甲素(triptolide，T10)是中药雷公藤提取物的有效成份之一，具有抗炎和免疫抑制的作用，临床上被应用于治疗风湿和类风湿关节炎，系统性红斑狼疮等自身免疫和炎症反应性疾病。不少的体外研究证实，雷公藤甲素的抗炎和免疫抑制效应是通过抑制炎症介质如IL-1β、TNFα等的表达释放和抑制诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)诱导表达实现的。最近的研究表明，雷公藤甲素具有神经保护作用，可以保护中脑黑质多巴胺能神经元免受脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的损伤，其机制可能与雷公藤甲素抑制LPS所致的小胶质细胞的活化以及抑制LPS所致的炎症反应有关。T10对AD脑内炎症和免疫反应影响的研究，到目前为止还少见有文献报道。本研究首次用T10处理β-淀粉样前体蛋白(β-Amyloid precursor protein，APP)基因和早老素Ⅰ(Presinilin 1，PS1)基因双转基因AD模型小鼠(APP／PS1 dtg)，研究T10对APP／PS1 dtg的影响，探讨T10治疗AD的可能性及其可能机制，为AD的防治提供新的方法。目的研究雷公藤甲素(T10)对APP／PS1双转基因AD模型小鼠海马内Aβ沉积与SP形成、小胶质细胞和星形胶质细胞的活化以及COX-2诱导表达的影响及其可能机制，为T10防治AD提供新的理论依据。方法1．动物实验取18只4.5月龄健康雄性APP／PS1双转基因AD模型小鼠，随机分为3组，分别腹腔注射5μg／kg．d T10(T10 H组)、1μg／kg．d T10(T10 L组)和等容量的溶媒(PLC组)共计45天；另取5只野生型非转基因同龄雄性小鼠，不作任何处理作为对照。45天后取材，左侧半大脑用于组织学染色，右侧半大脑用于蛋白分析。组织学研究：按无偏性体视学(Unbiased stereology)SUR原则(Systematic-Uniform-Random principle)，每10片取1片收集切片，6E10、GFAP、MAC1、COX-2免疫组织化学方法染色结合无偏性体视学定量分析研究Aβ、星形胶质细胞、小胶质细胞和COX-2等的变化，刚果红染色显示老年斑形成的改变，6E10与GFAP、6E10与MAC1、COX-2与GFAP、COX-2与MAC1等免疫荧光双标记显示星形胶质细胞和小胶质细胞与Aβ和COX-2等的关系。Western Blot蛋白分析海马Aβ和COX-2等蛋白水平的变化。2．细胞培养实验：(1)培养A172人星形胶质细胞，分别用0.2、1和5μg／L T10预处理A172细胞1h，随后用1mg／L LPS处理细胞3h和6h，逆转录-PCR(Reverse transcription-PCR，RT-PCR)、Western blot研究不同浓度T10对LPS所致COX-2表达的影响；电泳迁移率检测(Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA)研究T10对LPS所致的NF-κB／DNA结合活性的影响。(2)培养高表达人类COX-2蛋白(hCOX-2)的sf-9细胞系，分别用T10、COX-2酶活性抑制剂NS398和吲哚美辛处理细胞，放射免疫(Radioimmunoassay，RIA)检测培养液中PGE2的含量，研究T10对COX-2酶活性的影响。结果1动物实验结果：(1)T10处理APP／PS1 dtg 45 d，①可以抑制Aβ在海马的沉积，减少SP的形成。无偏性体视学定量分析发现，与PLC组的6E10阳性的Aβ斑的总面积比较，T10 H组海马Aβ斑的总面积减少了35％(P＜0.001)，T10 L组海马Aβ斑的总面积减少了18％(P＜0.05)。此外，T10 H组较T10 L组减少了21％，差异有统计学意义(P＜0.05)。②Western Blot蛋白分析也显示，海马内T10 H组Aβ蛋白水平最低，PLC组Aβ蛋白水平最高，T10 L组Aβ蛋白水平介于二者之间；③T10还可以减少6E10阳性的神经元的数量；④T10可以抑制沉积的Aβ聚集和纤维化，减少SP的形成。无偏性体视学定量分析发现，与PLC组的刚果红阳性SP比较，T10 H组海马SP总面积减少了32％(P＜0.001)，T10 L组海马SP总面积减少了21％(P＜0.05)。(2) T10可以抑制神经胶质细胞的活化与增生：①T10可以抑制小胶质细胞的活化与增生，减少小胶质细胞团簇的面积，无偏性体视学定量分析发现，与PLC组比较，T10 H组海马小胶质细胞总数减少了30％(P＜0.01)，T10 L组减少18％(P＜0.05)；T10 H组较T10 L组减少17％(P＜0.05)。②T10可以抑制星形胶质细胞活化，减少GFAP的表达以及抑制星形胶质细胞的增生，无偏性体视学定量分析发现，与PLC组比较，T10 H组海马星形胶质细胞总数减少了20％(P＜0.01)，T10 L组减少13％(P＞0.05)。(3) T10可以抑制APP／PS1 dtg AD模型小鼠海马内COX-2的表达／活化：①T10抑制COX-2在APP／PS1 dtg海马神经元内的表达／活化，减少COX-2阳性神经元的数量；②野生型小鼠海马内星形胶质细胞不表达COX-2，但在APP／PS1 dtg小鼠海马内星形胶质细胞表达COX-2，T10处理45天后，海马内COX-2阳性星形胶质细胞总数分别减少28％(T10 H，P＜0.01)和12％(T10 L，P＞0.05)；③Western blot蛋白分析显示，PLC组海马COX-2蛋白水平最高，其次为野生型小鼠，T10 H组海马内COX-2蛋白水平最低。2．细胞培养结果：(1) LPS刺激培养的A172人星形胶质细胞，可以导致COX-2表达增加，PGE2产生增加，T10呈剂量依赖性降低COX-2的表达和PGE2的产生；(2) T10对高表达hCOX-2的sf-9细胞系COX-2酶活性没有影响，提示T10对COX-2的抑制发生在转录水平；(3) LPS刺激培养的A172人星形胶质细胞可以引起NF-κB／p50／P65 DNA结合活性明显增高，T10呈剂量依赖性抑制NF-κB结合活性。结论本实验的结果表明，T10可以抑制APP／PS1 dtg小鼠海马内Aβ的沉积与纤维化形成SP，并且抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的活化与增殖以及抑制活化的星形胶质细胞诱导表达COX-2。说明T10具有NSAIDs的部分特性，对该模型小鼠或AD脑内慢性炎症反应具有一定的抑制作用，或可用于AD的预防和治疗。由于T10没有NSAIDs的毒副作用，因而可能在一定程度上优于NSAIDs。