鸭疫里默氏杆菌RA-WH9菌株Ⅱ型TA系统的鉴定与功能研究

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背景:毒素抗毒素(Toxin-antitoxin,TA)系统是广泛存在于细菌基因组和可转移元件中,由2个基因组成的共转录单元,其中1个基因编码不稳定的抗毒素分子,另一个基因编码稳定的毒素蛋白。鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)隶属于黄杆菌科,是一种不形成孢子的革兰氏阴性细菌。目前,在RA中尚未见相关TA系统的研究报道。TA的存在能提高细菌适应外界多变环境的能力。同时,依据TA的生物学特性,也可以将其开发为阻断特定生物学过程(如翻译起始)的生物制品。目的:鉴定RA-WH9菌株所含961质粒中预测到的TA系统,探究其生物学特性,以期增加人们对TA系统的认识,为其他菌种TA系统的研究提供参考。同时,也为鸭疫里默氏杆菌的防控提供理论基础,丰富TA在作为抗菌药、抗病毒药或抗肿瘤药应用上的研发思路。方法:1.生物信息学方法预测RA-WH9菌株所含961质粒上潜在的TA系统。2.分子生物学实验确认基因共转录,鉴定TA所属类别,BLAST比对相似序列,绘制进化树,进行同源性分析。3.原核表达毒素抗毒素蛋白,测定细菌生长曲线,透射电镜观察细菌形态、检测外膜疏水性,探究TA系统对细菌生长性能的影响;比较生物膜形成能力、最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)、持留菌存在量和脂多糖表达模式的差异,解析TA对细菌生存性能的影响。4.链特异性差异转录组测序,比较诱导前后基因表达差异,明确TA系统调控网络。结果:1.TA finder预测结果表明,RA-WH9菌株所含质粒961上存在3个毒素同源蛋白,2个抗毒素同源蛋白,但只有一对组合满足TA系统中毒素与抗毒素相邻要求(命名为Xre-Rel E系统)。2.共转录实验结果,证实Xre-Rel E系统基因共转录,序列比对结果显示,Xre/Rel E蛋白种属内同源性较高,但未见文献报道与之相似的TA系统。3.原核表达菌株生长曲线结果表明:毒素蛋白Rel E的高表达可显著抑制宿主菌的生长,而高表达抗毒素蛋白Xre可逆转这一抑制;透射电镜结果显示:高表达的毒素蛋白Rel E显著减少了宿主菌表面胞外多糖的形成,增强了宿主菌的疏水性;Live/Dead实验结果证实:毒素蛋白Rel E高表达后,宿主菌生物膜形成能力增强;MIC检测结果发现,毒素蛋白Rel E表达后宿主菌对替加环素与美罗培南更敏感(MIC值下降2倍左右);体外持留菌检测结果显示:毒素蛋白Rel E可促进宿主菌的持留性。4.差异转录组分析结果表明:TA系统可调控宿主菌应激反应、生物膜形成、运动性、耐药性及毒力等相关基因。结论:RA-WH9菌株961质粒上存在新的II型TA系统:Xre-Rel E,原核表达实验结果显示:Xre-Rel E系统可显著影响宿主菌的生长状态及其生存能力。
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