抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是生物体防御外界病原体侵袭时产生的一类小分子活性多肽,在生物先天免疫及获得免疫中起重要作用。目前,抗肿瘤化疗药物大多会损伤正常细胞,引起严重的副作用,甚至导致耐药性,人们迫切需要开发新型的广谱特效抗肿瘤药物。与传统抗肿瘤药物相比,抗菌肽具有独特的肿瘤细胞选择性杀伤机制和胞膜溶解机制等优势,毒副作用小,使其极有可能成为新一代抗肿瘤药物。但是由于抗菌肽的分子量小,分离纯化困难,从天然资源中提取抗菌肽非常有限;化学合成成本太高,不能满足实际需要;通过基因工程技术在微生物中大量表达抗菌肽极大的促进了抗菌肽的研究和应用。本研究采用实验室前期从新疆家蚕Bombyx mori体内获得的抗菌肽基因,构建至不同的表达载体,通过原核系统和真核系统优化表达获得新疆家蚕抗菌肽CecropinXJ。采用抑菌圈分析法检测CecropinXJ的最小抑菌浓度,通过透射电子显微镜观察其对多种病原菌的抑杀作用,并对抗菌肽的热稳定性、酸碱稳定性及溶血活性进行研究,结果表明CecropinXJ具有较强的热稳定性,酸碱耐受性和较低的溶血活性。采用MTT法检测CecropinXJ对8株肿瘤细胞及人胚肾上皮正常细胞增殖的影响,筛选出敏感株人食管癌Eca109细胞进行体内外抗肿瘤机制研究。通过扫描电镜,激光共聚焦显微镜观察新疆家蚕抗菌肽对人食管癌Eca109细胞骨架的影响,通过RT-PCR和western blot检测细胞骨架相关基因和蛋白的变化;通过流式细胞仪检测Eca109细胞凋亡率和细胞周期变化情况,扫描电镜、透射电镜、倒置荧光显微镜观察细胞形态学变化,western blot检测凋亡和周期相关蛋白的变化情况;建立裸鼠和Balb/c小鼠Ecal09细胞移植瘤模型,进行实验治疗学观察。通过病理组织学和免疫组化方法,观察相关细胞因子含量的变化。采用肿瘤体积和瘤重等指标,观察CecropinXJ对移植瘤小鼠的抑制效应;通过流式细胞仪检测新疆家蚕抗菌肽联合多种化疗药物对人食管癌Eca109细胞增殖和凋亡的影响;通过核酸免疫法制备鼠抗新疆家蚕抗菌肽多克隆抗体,激光共聚焦显微镜观察抗菌肽在肿瘤细胞内的定位情况,探讨新疆家蚕抗菌肽的抗肿瘤作用机理。主要研究结果如下:(1)重组原核表达载体pET32a-CecropinXJ在IPTG终浓度为0.8 mmol/L、培养温度为37℃的条件下诱导5 h,目的蛋白的表达量可达10 mg/L,重组蛋白主要以可溶性表达形式存在,可溶蛋白的表达量约占菌体总蛋白的35%,经金属螯合层析进一步纯化后的CecropinXJ融合蛋白纯度可达90%以上。由此实现了 CecropinXJ在大肠杆菌中高效、可溶性表达的目的。通过亲和层析Ni-NTA纯化的重组抗菌肽cecropinXJ在温度范围为4℃到100℃,pH值范围为pH 3.0至12.0内,对金黄色葡萄球菌的抑杀作用具有较高的稳定性。重组抗菌肽CecropinXJ对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为0.4 μM,同时,可抑制多种人源癌细胞增殖。(2)pYES2/CT/α Factor-CecropinXJ在酿酒酵母INVScl菌株中诱导重组蛋白表达120 h后,总蛋白的分泌量最高可达1.437g/L,重组CecropinXJ约为总蛋白的79.45%。重组CecropinXJ具有广谱的抑菌活性,其对大肠杆菌ATCC25922的最小抑菌浓度为0.81μμM。新疆家蚕抗菌肽通过直接破坏微生物细胞膜的作用方式抑制微生物生长。即使当抗菌肽浓度高达200μm 时,CecropinXJ对红血细胞溶血作用较小。因此,CecropinXJ可选择性地作用于细菌的细胞膜。在温度范围4℃至100℃内,pH值范围为2.0至12.0时,纯化的重组抗菌肽CecropinXJ对大肠杆菌ATCC25922仍保留较高的稳定性。(3)CecropinXJ可诱导Eca109细胞微管,微丝及细胞表面微绒毛结构浓度依赖性损伤,且可抑制肿瘤细胞迁移和侵袭。同时,CecropinXJ引发的微管解聚与肌动蛋白聚合密切相关,且具有浓度依赖性和时间依赖性下调α-actin,β-actin,γ-actin,α-tubulin和β-tubulin骨架基因的表达。(4)新疆家蚕抗菌肽具有时间和浓度依赖性抑制Eca109细胞增殖,细胞形态学检测观察肿瘤细胞内出现凋亡小体并能使Hoechst 33258荧光染料染色加深,细胞凋亡检测说明CecropinXJ具有诱导细胞凋亡的作用,并使细胞周期阻滞在G2/M期,使细胞内线粒体膜电位下降并使细胞内活性氧水平提高。同时,裂解PARP并导致caspase-3激活,影响细胞凋亡周期相关蛋白的表达。裸鼠移植瘤实验结果表明CecropinXJ对小鼠肿瘤体积增长具有一定的抑制作用,10 mg/kg抗菌肽组与生理盐水对照组相比其抑瘤率具有显著差异(p<0.05),但对小鼠体重及小鼠脾重无显著影响,说明该药物没有明显的毒副作用。(5)建立Balb/c荷瘤小鼠模型,探讨新疆家蚕抗菌肽CecropinXJ对Eca109细胞荷瘤小鼠作用后,是否通过影响机体免疫应答发挥抗肿瘤作用。移植瘤实验表明,10 mg/kg CecropinXJ对Eca109细胞移植瘤具有显著的抑制作用。10 mg/kg CecropinXJ给药组肿瘤体积和肿瘤重量与生理盐水对照组相比,具有显著差异(p＜0.05)。CecropinXJ抑制肿瘤生长过程中,可抑制肿瘤组织癌细胞的浸润生长现象,上调表达VEGF和bFGF,而对小鼠体内脏器无影响。与对照组相比,CecropinXJ对荷瘤小鼠的抑瘤作用不能够显著促进CD4,IL-4和IFN-y的表达,同时也不涉及脾脏中DCs表面分子的表达(p>0.05),但对TNF-α的表达具有显著的促进作用(p<0.01)。这说明CecropinXJ可以显著抑制荷瘤小鼠体内肿瘤的生长,在该过程中,可能并不通过影响机体免疫应答发挥抗肿瘤作用。(6)新疆家蚕抗菌肽CecropinXJ与化疗药物阿霉素(doxorubicin,ADM)、卡铂(Carboplatin,CBP)、顺铂(Dichloro-Diamineplatinum,DDP)、环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)分别单独用药或联合用药均可抑制Eca109细胞的增殖作用,联合用药组与各药物单独处理组相比,细胞凋亡率,活性氧水平及线粒体膜电位均具有显著性差异(p<0.05)。在体外实验中,抗菌肽与化疗药物ADM、DDP和CTX联用对Eca109细胞具有增殖抑制作用和凋亡诱导作用。新疆家蚕抗菌肽CecropinXJ与ADM、DDP和CTX联合作用Eca109细胞具有协同作用,而与CBP联合作用Eca109细胞则具有拮抗作用。(7)新疆家蚕抗菌肽处理Eca109细胞不同时间后,分别用抗菌肽抗体和荧光标记的二抗处理,激光共聚焦观察的结果表明,随着抗菌肽作用时间的延长,CecropinXJ首先破坏细胞膜表面微绒毛结构,通过裂解细胞膜逐步向细胞质中渗透,造成细胞内含物泄漏,细胞膜萎缩,最后进入细胞核,杀伤肿瘤细胞。