【摘 要】
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[目的]本实验旨在构建一种VEGF基因的RNA干扰的慢病毒载体序列,并且使其在人肝癌细胞MHCC97L中表达,最终实现VEGF基因在MHCC97L细胞中沉默。[方法]根据人VEGF基因序列,设计并
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[目的]本实验旨在构建一种VEGF基因的RNA干扰的慢病毒载体序列,并且使其在人肝癌细胞MHCC97L中表达,最终实现VEGF基因在MHCC97L细胞中沉默。[方法]根据人VEGF基因序列,设计并合成包含靶序列的互补DNA链,连接线性化的plenti6.3-MIR载体,构建miRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5α,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒,测定其滴度。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L,用Real-time PCR检测RNAi组(MHCC97-200)、阴性对照组(MHCC97-NEGA)和空白对照组(MHCC97-空白)中VEGF的表达情况,确定其干扰VEGF表达的有效性。[结果]测序证实VEGF基因RNAi慢病毒载体质粒构建成功。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L48h后,VEGF基因在mRNA水平抑制了72.2%。设计包装的3种序列的慢病毒载体均可明显“沉默”MHCC97L细胞中的VEGF基因表达,其中miR-200序列效果最佳,其对VEGF基因表达的干扰效率可达72%,[结论]VEGF基因RNAi慢病毒载体构建成功,并实现在人肝癌细胞MHCC97L中的表达。
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