研究背景:2型糖尿病已成为威胁人们生命和健康的主要社会问题,深入探讨其病因及危险因素,对有效防治疾病具有非常重要的意义。2型糖尿病是遗传和环境因素长期作用的结果,胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足是其重要的两个发病机制。长期高脂饮食可以导致肥胖、胰岛素抵抗,成为2型糖尿病的高危人群。而高蛋白饮食对肥胖患者胰腺内分泌功能的影响尚无定论,对胰腺β细胞是否存在高蛋白毒性尚未可知。多数的动物实验和临床研究显示:短期高蛋白饮食可刺激胰岛素分泌,对2型糖尿病患者具有一定的降糖作用,认为高蛋白饮食可减少2型糖尿病的发病风险,改善血糖控制,是一种有效的高血糖饮食干预疗法。但近年来的流行病学调查结果显示饮食蛋白增加伴随着2型糖尿病发病率迅速增高,从而对长期高蛋白饮食利于血糖控制这一观念提出了挑战。饮食蛋白对机体糖代谢及胰岛素分泌的影响十分复杂,它与研究对象的遗传特征、营养状况、摄入蛋白质的种类、形式以及摄入时间等多种因素有关。目前研究均限于正常和糖尿病个体,尚无对肥胖个体胰腺功能的长期系统研究。除氨基酸直接刺激外,进食高蛋白餐后引起的肠促胰岛激素--胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)也调节机体胰岛素的分泌。该激素是食物在肠道的消化吸收过程中,刺激肠道内分泌细胞—L细胞分泌的脑肠肽,可呈葡萄糖依赖性的作用于胰岛β细胞,促进胰岛素基因转录、合成和分泌,是肠道产生的最强的促胰岛素分泌激素。近年来研究发现2型糖尿病患者GLP-1分泌减少,β细胞对GLP-1敏感性降低,认为GLP-1减少是胰岛β细胞功能减退的重要因素,在2型糖尿病的发病机制中占有重要地位。血浆内源性GLP-1水平与所进食物的种类相关,单餐研究显示高蛋白餐可使GLP-1分泌增多。目前尚无长期高蛋白饮食对肥胖个体GLP-1分泌影响的相关报道。胰十二指肠同源盒-1(pancreatic duodenal homeobox-1,PDX-1)是β细胞内重要的转录因子,参与β细胞胰岛素基因的转录调控,来影响胰岛素的生物合成及分泌。GLP-1可通过上调PDX-1基因和蛋白质表达,促进胰岛素分泌。很多实验已经证实长期高糖或者高脂通过抑制PDX-1表达,降低胰岛素释放,而长期高蛋白饮食是否通过调节GLP-1、PDX-1的表达来调控胰岛素的分泌,目前尚未见此方面的相关研究报道。本研究通过对营养性肥胖大鼠进行长达24周的等热量高蛋白喂养,观察其胰岛形态、功能改变及胰腺组织胰岛素、PDX-1、回肠组织GLP-1的基因转录和蛋白表达情况,探讨饮食中富含蛋白成分对肥胖个体胰岛β细胞形态和内分泌功能的影响,并且进一步研究其作用机制是否与GLP-1、PDX-1有关。目的:本研究通过观察长期给予等热量高蛋白饮食后,营养性肥胖大鼠体重、糖代谢、胰岛素分泌功能及血浆胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的含量变化,胰腺中胰岛素、PDX-1及回肠组织GLP-1的mRNA及蛋白表达情况,以及肾脏功能和形态学的改变,探讨饮食中富含蛋白成分对肥胖个体糖代谢、胰岛β细胞形态功能以及肾脏的影响及其具体发生机制。方法:将出生21天的Wistar大鼠采用高脂饲料喂养14周,建立营养性肥胖大鼠模型34只,再将肥胖大鼠分为高蛋白饲料组(HP组,n=12,蛋白质主要来自猪肉粉)、高脂饲料组(HF组,n=11)和普通饲料组(NC组,n=11),三组饲料每百克的热量基本相同,正常等热量饲养24周。观察饲养期间三组大鼠体重、空腹血糖(FBG)的变化。至24周,测定空腹血浆GLP-1、胰岛素(FINS)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、24 h尿白蛋白(ALB)等指标含量,并行静脉葡萄糖耐量试验(IVGTT),观察三组肥胖大鼠葡萄糖刺激下的胰岛素分泌情况。将大鼠处死后测定内脏脂肪含量,并分别应用RT-PCR法测定胰腺组织胰岛素、PDX-1及回肠组织GLP-1的mRNA表达情况,免疫组织化学方法观察上述组织中的蛋白表达情况,并观察三组大鼠肾脏组织形态学特点。结果:1、体重及内脏脂肪含量:分组饲养8周后,HP组体重与NC组相比虽有下降趋势,HF组有升高趋势,但差异均无统计学意义(分别为P=0.27,P=0.25)。16周开始,三组体重出现统计学差异并维持至24周。与NC组相比,24周时HP组体重、内脏脂肪均显著降低[分别为(490.92±39.47)g vs(545.55±31.08)g,P＜0.01;(22.42±7.04)g vs(32.33±9.27)g,P＜0.05],HF组则均明显增加[分别为(656.01±58.49)g vs(545.55±31.08)g,(55.33±17.81)g vs(32.33±9.27)g,P均＜0.01]。2、FBG与IVGTT结果:0、12和24周时三组FBG水平无统计学差异(P＞0.05)。IVGTT中,三组各时间点血糖水平亦均无统计学差异(P＞0.05);与NC组相比,HP组5、10min胰岛素及0～10min胰岛素曲线下面积均显著降低[5min:(91.56±21.72)μIU/mL vs(121.29±34.03)μIU/mL,P＜0.05;10min:(58.62±15.80)μIU/mL vs(81.12±24.36)μIU/mL,P＜0.05;0～10min(132.46±33.42 uIU/mL vs(175.59±58.33)uIU/mL,P＜0.05)],0～120min胰岛素曲线下面积亦呈降低趋势[(227.64±54.34)uIU/mL vs(287.91±76.58)uIU/mL,p=0.086]。而HF组0min胰岛素显著增高[0min(40.21±14.12)μIU/mL vs(27.48±11.31)μIU/mL,P＜0.05],5min亦达高峰,但峰值略低于普通组[(110.52±28.93)μIU/mL vs(121.29±34.03)μIU/mL,p=0.12],10min显著升高[(98.15±27.58)μIU/mL vs(81.12±24.36)μIU/mL,P＜0.05],余时间点胰岛素及0～120min胰岛素曲线下面积均具有升高趋势[(315.92±82.54)uIU/mL vs(287.91±76.58)uIU/mL,p=0.16)]。3、血浆GLP-1含量:与NC组相比,空腹血浆GLP-1水平HP组显著降低[(0.52±0.13)μg/L vs(0.71±0.19)μg/L,P＜0.05],HF组则有增加趋势[(1.03±0.28)μg/L vs(0.71±0.19)μg/L,p=0.11]。4、血清BUN、Cr与24 h尿ALB含量:HP组BUN含量显著高于NC组[(7.02±0.86)mmol/L vs(5.61±0.46)mmol/L,P=0.001],HF组与NC组无差异,三组Cr与24 h尿ALB含量比较均无统计学差异(P＞0.05)。5、免疫组化图像分析:(1):胰岛形态学分析:免疫组化图像分析结果显示:与NC组相比,HP组的胰岛大小[(658944±103586)vs(697419±123143)um~2]、胰岛染色阳性面积比率[(48.42±5.03)%vs(50.28±4.15)%]及平均灰度[(102±15)vs(120±18)]均无显著差异(P均＞0.05),而HF组较NC组虽胰岛增大[(1250560±347510)vs(697419±123143)um~2,P＜0.05],但染色阳性面积比率显著降低[(40.35±5.16)%vs(50.28±4.15)%,P＜0.05)],平均灰度则明显升高[(157±23)vs(120±18),P＜0.01]。(2)胰岛PDX-1表达分析:与NC组相比,HP组的胰岛染色阳性面积比率有降低趋势[(24.42±3.42)%vs(32.87±6.35)%,P=0.072],平均灰度则无统计学差异[(135±13)vs(130±15),P＞0.05],高脂组染色阳性面积比率则显著降低[(18.58±4.38)%vs(32.87±6.35)%,P＜0.05],平均灰度明显升高[(163±20)vs(130±15),P＜0.01],提示β细胞内PDX-1表达降低。(3)回肠GLP-1表达分析:与NC组相比,HP组GLP-1蛋白表达平均光密度(OD)无统计学差异[(0.389±0.023.)vs(0.415±0.034),P＞0.05],但累计光密度(IOD)有降低趋势[(27431±5813)vs(36601±5083),P=0.081]。HF组OD、IOD均显著降低[(0.341±0.056)vs(0.415±0.034),(20928±4378)vs(36601±5083),P均＜0.05)]。(4)三组大鼠肾脏组织未见明显差异。6.RT-PCR分析:(1)胰岛素mRNA水平的表达:胰岛素与内参照的灰度比HP组0.45±0.16,显著低于NC组(0.73±0.08)和HF组(0.64±0.13)(P均＜0.05),后两组差异无统计学意义。(2)PDX-1 mRNA水平的表达:HP组值为0.70±0.12,较NC组(0.87±0.09)有降低的趋势(P=0.102),HF组(0.58±0.17)则较NC组明显降低(P＜0.05)。(3)GLP-1mRNA水平的表达:HP组0.86±0.09,HF组0.83±0.14,NC组0.89±0.11,三组间均无显著性差异。结论:1、长期等热量高蛋白饮食可引起大鼠胰岛素分泌降低,但该组大鼠的胰岛β细胞未出现形态学改变。2、高蛋白组大鼠的血浆GLP-1下降,回肠GLP-1蛋白表达水平亦有降低趋势,故高蛋白饮食可引起GLP-1表达受抑制。3、高蛋白组大鼠的胰腺PDX-1基因转录及蛋白表达均有降低趋势,推测高蛋白饮食可能引起PDX-1表达受抑制。4、高蛋白组肥胖大鼠体重较普通组减轻,特别是腹部脂肪减少,分析高蛋白饮食具有减肥作用。5、长期等热量高蛋白饮食可能通过抑制GLP-1、PDX-1的表达及减轻腹部脂肪引起胰岛素分泌减少。6、长期等热量高蛋白饮食未导致肥胖大鼠肾脏功能受损。