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GMC氧化还原酶家族(Glucose-Methanol-Choline oxidoreductase family)是生物体内众多氧化还原酶类的一种。该酶家族成员广泛地分布于多种生物体中,在生物体发育及代谢过程中发挥着重要的作用,如参与葡萄糖和胆碱代谢等。GMC氧化还原酶家族在昆虫基因组中是一个较大的家族,并且在不同昆虫中具有一定的保守性。尽管如此,昆虫中GMC氧化还原酶的功能研究仍然较少。本研究以家蚕为模式,研究了家蚕GMC氧化还原酶的进化历程和表达特征,并探究了GMC基因在家蚕抵抗病原微生物过程中的作用。蜕皮激素氧化酶(Ecdysone Oxidase,EO)属于GMC氧化还原酶家族,是蜕皮激素3位异构化途径上的限速酶。蜕皮激素3位异构化途径在很多昆虫,尤其是鳞翅目昆虫体内均有发现。蜕皮激素的代谢对于保持昆虫体内蜕皮激素正确的滴度变化致关重要。蜕皮激素3位异构化途径在这个过程中究竟有多大作用还未有研究。本研究从家蚕中克隆了蜕皮激素3位异构化途径上的两个关键基因—EO和3DE-3a-reducase的候选基因。通过真核表达表达出候选蛋白,酶活测定证实了他们的活性,并通过实验验证了这两个基因在家蚕食桑期和变态期的功能。所取得研究结果如下：1.家蚕基因组中GMC氧化还原酶家族的鉴定及注释本研究在家蚕基因组中鉴定出43个GMC基因,该数目在现今已测基因组的昆虫中是最多的。同其它昆虫中相似,家蚕flotillin-2基因第二内含子里有一个高度保守的GMC基因簇,串联排布着15个GMC基因。然而在这个保守的GMC基因簇外,家蚕GMC基因经历了一个大的扩增。系统发生分析表明家蚕GMCB亚家族包含22个基因,其中有18个位于保守的GMC基因簇外,我们称之为家蚕扩增基因(Silkworm Expansion genes, SEs)。家蚕GMCB亚家族成员的扩增是导致家蚕GMC氧化还原酶基因数目较大的主要原因。GMCβ亚家族中有18个基因(SEs)散在地分布在基因组中,相对进化速率分析表明SEs的进化速率显著快于保守的GMC基因簇内的GMCB亚家族成员,这种快速的进化速率暗示了它们功能的分化。2.家蚕基因组中GMC氧化还原酶基因的表达及其在免疫体系中的作用利用RT-PCR的方法分析GMC基因,尤其是GMCβ亚家族基因在家蚕组织和时期的表达。结果表明家蚕GMCβ亚家族成员在组织和时期的表达模式多有不同,即使在系统发生树上聚类在一起的基因的表达模式也有差异,暗示了GMCβ亚家族成员在进化过程中有了功能的分化。利用病原菌感染家蚕后制备的基因芯片的数据,分析了家蚕GMC基因的表达变化。结果发现在病原微生物感染后,有16个GMC基因的表达上调,有意思的是在这16个基因中,有14个属于GMCB亚家族。进一步的实验证实干涉其中三个上调表达的基因(BmGMC1, BmGMC12和BmGMCJ33)能显著降低家蚕对病原微生物的抵抗能力,说明家蚕GMCβ亚家族的扩增和家蚕抵抗外源微生物的侵染有关。3.家蚕蜕皮激素氧化酶和3DE-3a-还原酶的鉴定利用海灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis) EO和3DE-3α-reducase基因编码的氨基酸序列,分别在家蚕中鉴定出了这两个基因的候选。通过RACE技术获得了候选基因的全长序列。在毕赤酵母中异源表达两个候选基因,我们检测表达的蛋白分别具有EO和3DE-3α-reducase活性。表达分析表明BmEO基因只在中肠表达,蛋白质定位于中肠杯状细胞细胞质内。家蚕Bm3DE-3α-reducase基因在中肠和马氏管中均有表达,表达的蛋白位于中肠杯状细胞细胞质及马氏管主细胞内。时期表达分析,这两个基因均从家蚕5龄开始时表达,在食桑期有持续表达,并在变态期高量表达。结果表明这两个基因的表达与蜕皮激素滴度变化是相关的。4.家蚕蜕皮激素氧化酶和3DE-3a-还原酶的功能研究家蚕BmEO和Bm3DE-3α-reducase基因在食桑期和变态期均有表达,暗示了蜕皮激素3位异构化途径在家蚕这两个时期都会起作用。利用RNA干涉等实验来证实蜕皮激素3位异构化途径在这两个时期的作用。在食桑期,我们发现家蚕会通过该途径来降解桑叶中的植源性蜕皮激素,而当该途径异常时,家蚕会启动或增强另一个蜕皮激素代谢途径——cyp18α1基因参与的C26位的羟基化及氧化途径来降解植源性蜕皮激素,说明家蚕在降解植源性蜕皮激素的过程中具有一定的冗余性。在变态期,分别降低EO和3DE-3α-reducase基因表达后,家蚕体内蜕皮激素的滴度较高,受蜕皮激素响应的核受体基因表达异常,并且家蚕在上蔟期和蛹期的死亡率显著升高,说明蜕皮激素3位异构化途径对于家蚕的变态发育是十分重要的。从本研究所得到的结果,我们发现GMC氧化还原酶家族基因在进化过程中功能产生了大的分化,它不仅能参与昆虫的基础生理代谢及发育过程,而且在昆虫与植物的相关作用中也起着重要作用。GMC氧化还原酶家族在昆虫中的拷贝数较多,而且在家蚕基因组中经历了爆发式扩增,并且这种扩增与家蚕抵抗病原微生物的感染有关。综上所述,我们认为GMC氧化还原酶家族在不同昆虫的特异性扩增及功能分化有利于昆虫适应多种多样的生活环境。