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缺血/低氧预适应(Ischemic/Hypoxicpreconditioning，I/HPC)是一种内源性保护机制，即亚致死性缺血/低氧刺激可诱发包括脑在内的器官组织产生对继发严重缺血/低氧所致损伤的耐受。由I/HPC引起的脑组织保护机制为临床寻找防治缺血/低氧性脑损伤的策略提供了重要思路，但目前对这一机制的形成尚不清楚。已有研究表明，中枢神经系统内蛋白激酶C(PKCs)的激活或膜转位(membranetranslocation)可能介导了脑I/HPC的早期和晚期发生发展过程，但尚不知哪种或哪几种PKC亚型参与了这种神经保护作用，尤其缺乏对PKC亚型特异性膜转位和蛋白表达量在整体I/HPC动物脑内变化的系统探讨。PKCs为一类使底物蛋白分子内丝氨酸/苏氨酸残基发生磷酸化的蛋白激酶家族，并由10个亚型组成。根据激活方式的不同，将PKCs分为下列三组：①经典型PKC(cPKCα，βⅠ，βⅡ和γ)，其激活依赖于甘油二脂(DAG)、磷脂酰丝氨酸(PS)和Ca2+；②新奇型PKC(nPKCδ，ε，η和θ)，其激活不依赖于Ca2+，但需要DAG；③非典型PKC(aPKCζ和ι/λ)，其激活方式目前尚不完全清楚，但已知它的激活不需要DAG和C2+。本研究拟在这些PKCs亚型中，确定参与脑I/HPC发生发展的PKCs特定亚型，以进一步丰富人们对早晚期I/HPC形成的细胞信号转导机制的认识。
实验在室温20-22℃下进行，实验动物为成年(12-14周，体重18-20g)雄性BALB/c小鼠。动物实验方法参照美国国立卫生研究院(NIH)制定的《实验动物饲养和使用》指南(NIHPublicationNo.80-23，revised1978)进行。为了在整体动物水平上确定参与脑I/HPC形成的PKCs亚型，我们建立了自然低氧(auto-hypoxia)诱导的“小鼠整体I/HPC模型”，来模拟临床上的“窒息”过程。即成年健康BALB/C小鼠随机分为正常对照组(H0)、低氧暴露1次(H1)、重复性低氧2、3和4次(低氧预适应早期，H2-H4)，以及重复性低氧5和6次(4次重复性低氧小鼠恢复24h后，再进行第5和6次低氧刺激，即H5和H6为延迟性低氧预适应)等7组。低氧结束后，小鼠被断头处死，迅速分离前部大脑皮层和海马组织，样品在-70℃冰箱内冻存，待进行10种PKC亚型特异性膜转位水平和蛋白表达量的分析，以及神经颗粒素(Ng)磷酸化水平的检测。为了在离体水平上检测持续性低氧对PKCs亚型激活状态的影响，我们利用离体培养的人神经母细胞瘤细胞系—SH-SY5Y细胞，观察了不同时间的持续性低氧刺激下，SH-SY5Y细胞内PKCs亚型特异性膜转位水平的变化。将SY5Y细胞接种于含10％胎牛血清的DMEM培养基的培养瓶中，并置于37℃、95％空气/5％CO2、饱和湿度的CO2孵箱内培养。在进行SY5Y细胞持续低氧暴露时，气体成分为1％O2/5％CO2/94％N2，而低氧刺激时间则分别为：0、0.5、2、4、6、8、12和24h。低氧刺激结束后，进行活细胞计数，并用冰浴的PBS洗三次，然后将收集的细胞冻存于-70℃待用。为了在海马脑片上探讨NMDA受体、nPKCε和细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)的激活是否参与了I/HPC-诱导的神经保护作用，雄性BALB/c小鼠被断头处死、迅速剥离海马，并置于95％O2/5％CO2饱和的冰浴人工脑脊液(ACSF)。用McIlwain组织切片机，将海马进行冠状切片(400μm厚)。进行任何处理前，海马脑片要在室温下，95％O2/5％CO2饱和的ACSF溶液内温浴3h。实验时，海马脑片被分成5组，其中组1(正常对照，C)：脑片在95％O2/5％CO2饱和的ACSF溶液内温浴；组2(氧-糖剥夺，OGD)：脑片在95％N2/5％CO2饱和的无糖ACSF溶液内温浴45min来模拟严重缺血；组3(缺血预适应，IPC)：脑片在95％N2/5％CO2饱和的无糖ACSF溶液内温浴10min，95％O2/5％CO2饱和的正常ACSF溶液内恢复30min来模拟缺血预适应，然后再进行严重OGD刺激；组4(NMDA)：首先对海马脑片进行1μMNMDA预处理，然后给予严重OGD刺激；组5(药理阻断)：在IPC或NMDA预处理前30min，开始给予MK-801(10μM)、εV1-2(1μM)或PD98059(20μM)，来分别阻断NMD受体、nPKCε膜转位和ERK激酶(MEK)激活，最后给予严重OGD刺激来探讨NMD受体、nPKCε和ERK是否参与了海马脑片I/HPC的形成。实验结束后，海马脑片冻存在-70℃冰箱内待用。
本项研究应用蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白印迹(Westernblot)、免疫组化和PI染色等技术方法，探讨重复性低氧(H1-H6)、持续性低氧和氧-糖剥夺(OGD)对小鼠脑组织、SH-SY5Y细胞和海马脑片内PKCs亚型特异性膜转位水平和蛋白表达量的影响。所有实验数据均通过OnewayANOVA统计学检验，以均数±标准差(x±s)表示，并以Bonferroni法作显著性比较，其中p＜0.05具有显著性。实验结果如下：
(1)我们发现，cPKCβⅡ、γ和nPKCε的膜转位水平，而非蛋白表达量，在I/HPC小鼠(H1-H4组)的大脑皮层和海马组织内明显增高(p＜0.05，vsH0，每组n=6)。然而，对于cPKCα、βI，nPKCδ、θ、μ、η，以及aPKCι/λ和ζ来讲，无论膜转位还是蛋白表达量在I/HPC小鼠(H1-H4组)的大脑皮层和海马组织内均无明显变化。与上述Westernblot结果类似，免疫组化显示，H3组小鼠大脑皮层内cPKCβⅡ、γ和nPKCε发生了明显的亚细胞重新分布。这些结果表明，cPKCβⅡ、γ和nPKCε的激活可能参与了脑I/HPC的发生发展过程。(实验结果已发表在：①NeuroscienceLetters，2005，384：1-6；②BrainResearch，2005，1060：62-72。总IF：4.4)
(2)为了验证上述从整体动物所获实验结果，我们进一步检测了持续性低氧暴露下，SH-SY5Y细胞内cPKCs和nPKCs等9个亚型膜转位水平的变化情况。
结果发现，在持续性低氧暴露下，SH-SY5Y细胞内cPKCα、βⅠ、βⅡ和nPKCε，而非nPKCδ、η、μ和θ，膜转位水平呈时间依赖性(0.5-24h)增高(p＜0.05，每组n=8)。同样，免疫组化结果显示，持续性低氧暴露6h后，SH-SY5Y细胞的胞浆内cPKCα、βⅠ、βⅡ和nPKCε明显地向核周或膜相关区域转移。此外，无论在正常还是持续低氧暴露条件下，SH-SY5Y细胞内均未检测到cPKCγ的存在。这些结果提示，持续性低氧同样可以通过触发膜转位的形式，来诱发SH-SY5Y细胞内cPKCα、βⅠ、βⅡ和nPKCε的激活。(实验结果将发表在：BrainResearch，2006年，已接收。IF：2.4)
(3)为了检测nPKCε的神经保护作用，我们发现，IPC-诱导的nPKCε膜转位是通过NMDA受体调节，并且IPC和NMDA预处理均能保护海马脑片CA1区神经元免遭继发严重氧-糖剥夺(OGD)的损伤。此外，还发现，nPKCε膜转位抑制剂-εV1-2和ERK1/2上游激酶MEK抑制剂-PD-98059，均能抑制IPC和NMDA预处理激发的神经保护作用。结果表明，在海马脑片CA1区，由IPC-诱导的神经保护作用有NMDA受体、nPKCε和下游ERK1/2等激活的参与。
(实验结果将发表在：JNeurosurg.Anesth.，2006年，已修稿。IF：1.2)(4)此外，我们还发现，I/HPC鼠(H1-H4)大脑皮层和海马组织内神经颗粒素(neurogranin，cPKCγ可能的作用底物之一)磷酸化水平明显增高(p＜0.05，每组n=8)，从而进一步提示I/HPC鼠脑内cPKCγ的激活。(实验结果已发表在：NeuroscienceLetters,2006，391(3)：150-153。IF：2.0)
总之，本研究通过对整体I/HPC鼠脑组织内PKCs亚型特异性膜转位水平和蛋白表达量变化的系统探讨，发现在10种PKCs亚型中，只有cPKCβⅡ、γ和nPKCε膜转位水平而非蛋白表达量的增高可能参与了脑I/HPC的发生发展过程；这一实验结果同时在离体培养的SH-SY5Y细胞和海马脑片上得到了证实。PKCs特定亚型作为药物开发的靶分子，本研究结果应可成为临床寻找防治缺血/低氧性脑损伤药物的依据。