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绵羊毛纤维可分为角质层、皮质层和髓质层,主要由角蛋白(Keratin)和角蛋白关联蛋白(Keratin associated protein)组成。皮质部是绵羊毛纤维的主要部分,决定羊毛纤维品质,同时大多数的角蛋白和角蛋白关联蛋白存在于毛纤维皮质部,因此毛纤维皮质部蛋白的性质决定毛纤维的形成及其物理特性。但是,皮质部蛋白的功能尚不明确。本实验室前期发现绵羊KAP13-1(sKAP13-1)在毛囊中高表达,因此本研究通过构建超表达绵羊KAP13-1的转基因小鼠和检测与绵羊KAP13-1互作的角蛋白来探索绵羊KAP13-1在羊毛纤维形成中的功能及其对毛纤维物理特性的影响。得到结果如下:.1.毛纤维皮质部特异表达绵羊KAP13-1转基因小鼠制备及鉴定(1)首先制备绵羊KAP13-1抗体,通过免疫组化检测表明绵羊KAP13-1在毛纤维皮质部表达;然后,利用本课题组已鉴定的具有绵羊皮质部特异表达活性的KAP11-1启动子序列成功构建了皮质部特异表达绵羊KAP13-1和绿荧光蛋白ZSG的转基因小鼠,命名为pKAP11-1-sKAP13-1-2A-ZSG-Plus(简称Plus小鼠)。Plus小鼠检测结果显示绵羊KAP13-1和绿荧光蛋白ZSG同时在毛纤维皮质部特异表达,并且其在绵羊KAP11-1启动子序列驱动下呈现出毛囊生长周期性表达模式。结果说明我们已获得皮质部特异超表达绵羊KAP13-1的转基因小鼠,其可用以后续的研究中。(2)对Plus小鼠的表型进行检测,发现Plus小鼠经历正常毛囊生长周期,并且其具有4种完整的背部毛纤维类型Guard,Aw1,Zigzag和Auchene,说明在Plus小鼠中,绵羊KAP13-1没有影响正常的毛囊生长周期进程和毛纤维的类型。然后,本研究比较了 Plus小鼠,皮质部超表达绿荧光蛋白ZSG的pKAP11-1-ZSG小鼠和野生小鼠的毛纤维直径,统计分析结果显示在同种类型的小鼠中,Gurad型毛纤维直径在不同性别之间具有显著差异,雄性小鼠的Gurad型毛纤维直径显著大于雌性小鼠;在相同性别中,与pKAP11-1-ZSG小鼠和野生小鼠相比,Plus小鼠的Guard型毛纤维显著变细。统计结果表明sKAP13-1对小鼠Gurad型毛纤维的细度具有显著影响。2.KAP13-1蛋白的结构分析及其互作角蛋白的筛选(1)通过对绵羊KAP13-1蛋白的序列分析发现KAP13-1中存在类似A型,C-C-X-P-X和B型,C-C-X-S/T-S/T的五肽结构,并且两种五肽结构在物种间具有较高的同源性;然后KAP13-1的三级结构预测表明其存在大量的无规则卷曲结构;因此,绵羊KAP13-1可能通过形成二硫键,氢键等实现其与角蛋白的互作。(2)本研究利用人KAP2-1和人K86的互作作为阳性对照,建立利用GST-Pulldown检测蛋白互作的技术平台;然后,根据绵羊角蛋白的表达模式筛选毛囊皮质部表达的角蛋白K33、K34、K39和K86为候选蛋白,通过GST-Pull down技术检测绵羊KAP13-1与K33、K34、K39和K86的互作。结果显示没有检测到绵羊KAP13-1与K33、K34、K39和K86之间的相互作用,说明绵羊KAP13-1可能与其他皮质部蛋白相互作用进而发挥功能。因此,本研究发现绵羊KAP13-1在皮质部表达;成功构建了毛囊皮质部特异表达sKAP13-1的转基因小鼠并发现sKAP13-1对毛纤维的细度有显著影响,但是没有检测到其对毛囊的生长周期和毛纤维的类型具有显著作用;绵羊KAP13-1蛋白的结构分析表明其可能通过形成二硫键等与相应角蛋白发生互作;然后,利用GST-Pull down技术没有检测到KAP13-1与K33、K34、K39和K86之间的相互作用,推测KAP13-1可能与其他皮质部角蛋白相互作用进而促进其功能的实现。