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斑节对虾(Penaeus monodon)又称为黑虎虾,作为世界三大养殖虾类之一。是目前世界上普遍养殖的优良种类。斑节对虾养殖业中仍然通过单侧眼柄切除技术促进雌虾卵巢成熟和产卵。然而,该技术会导致亲虾高死亡率和产卵质量低等问题。为了寻找一种替代方法,必须了解斑节对虾卵巢发育的机理,尤其是分子机理。本研究以斑节对虾为研究对象,从本实验室转录组中筛选出PmRBL和PmChk1cDNA片段,利用SMART-RACE等分子生物学技术克隆得到了它们的基因全长,克隆了PmChk1基因组全长,对PmChk1进行体外重组表达、蛋白纯化和制备抗体,对PmRBL和PmChk1进行双链RNA干扰检测相关基因的表达,此外还研究了两种蛋白在各组织、卵巢各期、注射5-HT和切眼柄后卵巢的表达量。我们比较系统的探究了斑节对虾PmRBL和PmChk1的生物学信息和蛋白功能,为后续深入研究斑节对虾卵巢发育的分子机理提供依据。主要研究总结如下:(1)转录组中筛选出PmRBL cDNA片段,使用RACE技术克隆了斑节对虾RBL基因全长,利用不同软件进行序列生物信息学分析。PmRBL cDNA序列全长4,069 bp,包含54 bp的5′-untranslated region(UTR),772 bp的3′UTR和可以编码1,080个氨基酸的3,243 bp开放阅读框,理论分子量为121.76 kDa。多重序列比对显示PmRBL基因有一个保守的Rb-A结构域(393–588 aa)和CYCLIN结构域(781–918 aa)。树状图描述了基于不同物种Rb蛋白相似性的进化关系,脊椎动物Rb蛋白聚为一支,斑节对虾和包含凡纳滨对虾的无脊椎动物聚为一支。qRT-PCR结果分析表明PmRBL广泛分布于斑节对虾各个组织,其中在鳃中的转录表达量最高,肝胰腺和卵巢次之,脑中转录表达量最低。PmRBL的转录表达量在卵巢发育III期最高,其次是IV和V期,I和II期表达量最低。PmRBL的表达量在卵巢发育III,IV和V期显著高于I和II期。注射5-HT 12-96 h后,PmRBL在卵巢中的表达量显著上调。PmRBL在切除眼柄后3-96 h斑节对虾卵巢中的转录表达量显著上调。注射dsRNA-RBL成功的沉默了卵巢和肝胰腺中的PmRBL。原位杂交实验检测PmRBL在斑节对虾肝胰腺中的表达位点和表达量,原位杂交的结果和定量检测结果是一致的。注射dsRNA-RBL 6-24 h后,PmCDC2和PmCyclin B在肝胰腺和卵巢中的表达量显著降低。PmRBL在注射dsRNA-p53 12-96 h后斑节对虾卵巢和肝胰腺中的转录水平显著下调。注射dsRNA-RBL后的性腺指数显著低于注射dsRNA-GFP后的对照组。结果表明,在斑节对虾的卵巢发育过程中PmRBL起正调控作用。(2)转录组中筛选出PmChk1 cDNA片段,使用RACE技术克隆了斑节对虾Chk1基因全长。PmChk1 cDNA序列全长3,334 bp,包含249 bp的5′-untranslated region(UTR),1,630 bp的3′UTR和可以编码484个氨基酸的1,455 bp开放阅读框,理论分子量为54.61 kDa。PmChk1完整基因组有11,081 bp含有10个外显子和9个内含子。重要的转录因子结合位点包括:3个IRF1、2个SREBP、NF-kB、ISGF3、HNF4、STAT1、PPAR、TATA-box和CpG岛。多重序列比对显示PmChk1有一个保守的S-TKc结构域(12–270 aa)。斑节对虾Chk1和蚤状溞Chk1有55%的相似性,分析表明斑节对虾Chk1氨基酸序列和蚤状溞最相近。树状图描述了基于不同物种Chk1蛋白相似性的进化关系,脊椎动物Chk1蛋白聚为一支,斑节对虾Chk1和包含蚤状溞Chk1的无脊椎动物聚为一支。qRT-PCR结果分析表明PmChk1广泛分布于斑节对虾各个组织,其中在卵巢,鳃和脑中的表达较高,肌肉中转录水平表达最低。PmChk1在卵巢发育I和II期表达量最高,III期转录水平最小。PmChk1的转录水平在籽虾期最高,在受精卵期最低。注射5-HT和DA 24-96 h后,PmChk1在卵巢中的表达量分别降低和升高。切除眼柄后3-96 h,PmChk1在卵巢中的表达量显著下调。注射dsRNA-Chk1成功的沉默了卵巢和肝胰腺中的PmChk1。原位杂交实验检测PmChk1在肝胰腺和卵巢中的表达位点和表达量,原位杂交的结果和定量检测结果是一致的。检测注射dsRNA-Chk1和dsRNA-GFP卵巢组织酶活,注射dsRNA-Chk1 24h-72 h后,Chk1组织酶活性显著低于对照组。免疫印迹实验表明注射dsRNA-Chk1后24和48 h PmChk1蛋白表达量与注射dsRNA-GFP后24和48 h对比明显减少。PmCDC2和PmCyclin B在注射dsRNA-Chk1 6-72 h后斑节对虾肝胰腺和卵巢中的表达量显著升高。PmChk1在注射dsRNA-p53 12-96 h后斑节对虾卵巢和肝胰腺中的表达量显著上调,PmChk1在注射dsRNA-RBL 6-96 h后斑节对虾卵巢和肝胰腺中的表达量显著上调。注射dsRNA-Chk1后的性腺指数显著高于注射ds RNA-GFP和PBS后的对照组。结果表明,在斑节对虾的卵巢发育过程中PmChk1起负调控作用。本研究分析了PmRBL和PmChk1基因的序列特征,qRT-PCR技术检测到PmRBL和PmChk1基因的mRNA在斑节对虾各个组织组织中均有表达只是表达量存在差异,在卵巢发育的各期相对表达水平不同,RNA干扰、原位杂交、组织酶活和免疫印迹技术检测到PmRBL和PmChk1基因在信号通路中是上下游的关系,RBL抑制Chk1的表达,Chk1抑制CDC2和Cyclin B的表达。因此PmRBL和PmChk1可能通过影响细胞周期,从而影响斑节对虾的卵巢发育。这些研究结果对深入了解斑节对虾的卵巢发育分子机理提供依据。