肿瘤侵袭转移相关基因MTA1最初是在1993年发现高表达于具有高转移潜能的大鼠乳腺癌细胞系中,后来证实MTA1不仅参与了肿瘤的侵袭转移过程,还参与了肿瘤其他多种恶性能力的调控,如细胞增殖、血管生成、耐放化疗等等,最终导致肿瘤的高复发和不良预后。虽然已经经历了20多年的研究历史,但是我们对于MTA1(cancer metastasis-associated gene1)的作用机制依然所知甚少。目前为止,关于MTA1的作用机制唯一比较清楚的就是核小体重塑和组蛋白脱乙酰化NuRD (Nucleosome Remodeling and histone Deacetylation)复合体。通过NuRD复合体,MTA1参与了多种肿瘤抑癌基因的转录抑制。然而,后来发现MTA1参与的许多过程都不依赖于NuRD复合体,并且NuRD无法解释MTA1对Pax5、BCAS3、FosB等基因的转录激活作用,因此除了NuRD之外,我们推测还存在其他未知的作用机制。至于MTA1的亚细胞定位,现有文献提示MTA1主要定位于胞核,而对于MTA1更精细的亚细胞定位目前还未见相关报道,而对于MTA1是否存在胞浆定位尚存在争议。一个蛋白在细胞中的精确定位及相互作用信息对于揭示其功能及机制具有非常重要的作用。因此,为了更深入地揭示MTA1在肿瘤中的功能机制,我们首先利用免疫组化,细胞免疫荧光、GFP标签追踪、Western Blot、IP及原位co-IP等多种技术对MTA1的核浆定位进行了一个全面系统地研究。通过对内源及外源MTA1的精确定位检测,我们发现MTA1在胞核及胞浆中均存在明显分布。同时我们还意外地发现MTA1在某些细胞的核膜上也有明显分布,而MTA1稳转高表达细胞系中获得的MTA1定位追踪图片则直接显示MTA1是一个核浆穿梭蛋白。MTA1在所有我们检测过的样品中均有表达,包括人及小鼠成体正常组织、小鼠胚胎组织、结肠癌组织、正常及肿瘤细胞系,表明MTA1在正常及肿瘤细胞均发挥重要作用。在正常成体组织,MTA1在脑、肝、肾及心肌等组织中表达量相对较高,并且除心肌和骨骼肌之外,MTA1主要定位于胞核。在骨骼肌,MTA1与SMN共定位于肌小节中的Z线上。而在小鼠胚胎组织,MTA1在脑、眼、脊髓等神经组织处具有明显高表达,并且在大部分组织中都主要定位于胞浆。通过对高密度结肠癌芯片染色结果的统计分析,我们发现胞核及胞浆MTA1均参与了肿瘤的进展过程,但在肿瘤细胞的分化调控中,核MTA1发挥着主要作用。MTA1在细胞核中发挥染色质高级结构调控因子的作用。染色质高级结构在调控基因表达及DNA相关生理过程中发挥着其重要的作用。在该部分研究中,我们首次发现肿瘤转移相关基因MTA1是一个染色质高级结构调控因子,它可以导致间期染色质及M期染色体发生显著的去凝聚作用。我们发现在细胞周期中,MTA1与DNA的相互作用呈现一个动态的、周期性的分离与结合的过程,该周期性过程在有丝分裂前期及末期染色质/染色体结构转换的过程中发挥重要作用。虽然MTA1与染色质重塑因子Mi-2具有相互作用并且共同位于NuRD复合体中,但是MTA1的染色质去凝集作用并不依赖于Mi-2。H1可以通过结合于DNA参与维持和稳定染色质的高级结构。我们的实验结果表明MTA1在胞内可以显著降低H1与DNA之间的相互作用,并且在M期MTA1与DNA的周期性结合与分离有助于调控H1与DNA之间的周期性结合能力,从而参与M期染色质与染色体结构的转换调控。虽然MTA1可以导致染色质高级结构发生广泛的去凝集作用,但是MTA1的高表达只对一小部分基因产生了明显的转录调控作用,包括转录激活和转录抑制双重调控作用。MTA1高表达后导致的差异表达基因在分布模式上具有明显的染色体偏向性,并且上调基因和下调基因具有相似的分布趋势。差异基因的精确定位结果显示,上调基因和下调基因大部分以成簇方式分布于染色体的同一区域中,表明MTA1具有结构依赖性的调控模式。因此,在本部分我们发现MTA1具有染色质高级结构调控因子的新功能,该功能在细胞周期中染色质/染色体之间的的结构转变过程中及间期染色质的转录活性中调控中均发挥重要作用。MTA1在胞浆中通过结合于纺锤体微管发挥抑制纺锤体检验点(SAC)激活的功能。在间期,MTA1少量定位于胞浆,通过与a-tubulin共定位,我们发现这部分MTA1主要沿着微管分布。在M期,MTA1具有周期依赖性的定位模式,其中大部分时间MTA1都主要定位于胞浆,结合于纺锤体微管并随之运动。在MTA1与细胞周期调控功能的探索过程中,我们发现MTA1对nocodazol引起的纺锤体检验点激活具有很明显的抑制作用。MTAl在HCT116细胞中的高表达会导致染色体排列及分离异常,从而显著增加微核及多核细胞的比例,这些现象都是SAC功能异常的标志性特征。TPR是一个核孔复合体蛋白,其在间期参与mRNA及蛋白的核外转运调控,而在M期则发挥SAC的调控功能。通过IP及免疫荧光共定位技术,我们发现MTA1与TPR在间期核膜及M期纺锤体上均具有相互作用。进一步的实验验证结果表明MTA1通过结合并抑制TPR的SAC正向调控功能从而抑制SAC的激活,并且MTA1可以与MAD1-MAD2复合体竞争结合TPR, MTA1高表达可以显著降低MAD1-MAD2的相互作用,而该相互作用在SAC激活过程中发挥着关键的作用。另外,MTA1的亚细胞定位及相互作用蛋白质组信息提示MTA1还具有RNA调控功能。有文献报道MTAl在核仁中为阴性表达,然而通过对内源及外源MTA1在核仁中的精确检测,我们确认MTA1在核仁中具有普遍但是相对较低的表达水平。高分辨率的免疫电镜技术结果显示MTA1在核仁中主要定位于致密纤维组分区(DFC)及颗粒区(FC)。 MTA1在核仁中的精确定位及相互作用蛋白信息均表明,MTA1在核仁中参与了rRNA的加工剪切及核糖体亚基的装配过程。另外,我们首次发现并确认MTA1在胞浆中存在于大量RNP颗粒中。MTA1RNP颗粒的相关特性分析结果表明,MTA1参与了RNA的运输、稳定性、翻译及应激状态下的储存调控。通过GO分析,我们发现在228个MTA1候选相互作用蛋白中有74(32.5%)个为RNA结合蛋白,并且MTA1相互作用蛋白质组高度富集于RNA调控相关功能类别之下,如RNA加工、剪切、翻译、稳定性、核糖体发生等等。转录组测序结果表明MTA1敲降后对966个可变剪切事件产生了显著影响。并且有趣的是,外源MTA1的高表达对其自身mRNA的可变剪切也具有显著影响。综上所述,我们发现MTAl是一个在核仁、胞核、核膜及胞浆中穿梭分布的蛋白；其在细胞周期中具有周期性的动态定位模式；利用MTA1的候选相互作用蛋白我们构建了MTA1在整个基因组中的相互作用网络。通过以上定位及相互作用信息结合大量的功能学验证,我们最终确立了MTA1的三大基础功能：1,染色质结构调控；2,RNA调控；3,细胞骨架相关调控。通过这三大基础功能,MTA1在细胞中发挥重要生理的功能, MTA1过表达将导致这些功能的异常调控从而促进肿瘤的发生及进展。