基于材料基因工程钙磷比和物相比关键因素对磷酸钙材料性能影响的研究

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羟基磷灰石(HA)具有很好的生物相容性和骨传导性,但是降解能力和成骨能力则较差。针对这一问题,本研究基于“材料基因组”计划,从仿生学角度出发,以期制备出与自然骨磷灰石结构、成分和性能更为接近的磷酸钙材料。通过不同的制备方法和条件得到了:钙磷比(Ca/P比)梯度变化的弱结晶HA和对应煅烧后的不同物相比的高结晶度磷酸钙、不同结晶度的HA、不同长径比晶粒的HA等一系列钙磷基材料,研究这些因素对材料理化性能和生物学性能的影响,筛选出比较优异的组别后,将材料结构和性能关联起来,并且进一步来确定和优化制备方案和参数,丰富材料基因库。首先,利用化学沉淀法制备了Ca/P比梯度变化(1.5、1.55、1.6、1.67)的弱结晶HA,将其煅烧后得到HA/β-TCP物相比梯度变化(0/10、3/7、6/4、10/0)的高结晶度磷酸钙。并通过XRD、FTIR、SEM等分析,对其物相、成分、形貌等进行了表征。随后对其理化性能和细胞学性能进行了研究,结果显示:减小Ca/P比可以有效提高弱结晶HA的蛋白吸附性能,1.5Ca/P比的弱结晶缺钙HA具有最佳的蛋白吸附性能;煅烧后不同物相比的高结晶度磷酸钙的蛋白吸附性能则随着β-TCP含量增加而下降,纯β-TCP的蛋白吸附性能最差;弱结晶HA整体上的蛋白吸附性能要明显优于高结晶度磷酸钙。弱结晶HA和高结晶度磷酸钙的P释放水平都随着Ca/P比的减小而逐渐升高,但是Ca离子的释放则存在很大变化,缺钙促进了弱结晶HA对Ca离子的吸附导致对应溶液中的Ca离子浓度降低;高结晶度磷酸钙释放的Ca离子浓度随着β-TCP含量的增加而升高。弱结晶HA的基本不存在矿化现象,而HA/β-TCP(物相比)为3/7的高结晶度双相磷酸钙(3/7BCP)相比于其他组发生了明显的矿化现象,可能与其特殊的微纳结构有关。Ca/P比为1.55的弱结晶缺钙HA具有最佳的细胞增殖活性,其碱性磷酸酶(ALP)活性和成骨相关基因的表达量也最高;其煅烧后对应的3/7BCP组的细胞学性能在高结晶度磷酸钙中也是最佳的,其增殖活性与成骨相关基因的表达量都是最高的;对弱结晶HA和对应煅烧后的高结晶度磷酸钙进行细胞学性能对比发现,两者的细胞增殖活性差距不大,但是弱结晶HA的更能提高间充质干细胞(BMSCs)的ALP活性,更能促进成骨相关基因的表达。随后对1.5Ca/P比的弱结晶缺钙HA进行了体外陈化实验,发现随着陈化时间延长弱结晶缺钙HA的结晶度和Ca/P比都有所提高,晶粒变大,并由球状向长棒状转化;随着陈化时间延长,弱结晶HA对成骨相关基因的表达上调作用越明显,陈化14天的弱结晶HA对m BMSCs成骨相关基因的上调作用最明显。根据前期体外成骨实验分别选择2组弱结晶HA(1.55HA和1.67HA)以及煅烧后得到的2组高结晶度磷酸钙(β-TCP和3/7BCP)与聚乳酸(PLA)复合后3D打印成多孔支架,并植入兔子股骨踝缺损,研究其体内成骨性能。实验结果显示:弱结晶HA复合支架比高结晶度磷酸钙复合支架具备更好的成骨效果,在6周时就已经有大量的新骨生成,12周时材料也有明显的降解,而高结晶度磷酸钙复合支架在6周时几乎不成骨或很少成骨;1.55Ca/P比弱结晶缺钙HA复合支架和1.67Ca/P比弱结晶HA复合支架成骨性能都非常优异,但是差距不明显;3/7BCP复合支架在12周时比β-TCP成骨更好,而且后者内部被大量的纤维组织包裹,造成其成骨量下降。将高通量和水热法结合起来,通过改变水热温度和原料初始Ca/P比这两个变量一次性批量制备了20组不同的HA,然后对其进行测试表征。结果显示:水热法都可以制备出物相纯度高的HA,随着水热温度提高,产物HA的结晶度提高,但是Ca/P比也会随之降低,针棒状HA长径比变大,直到170℃时转化为六方板片状;随着合成过程中初始Ca/P比的增加,得到的HA结晶度有小幅提升,形貌上开始由开始的长棒状向短棒状和球状转变。经过物相检测和形貌观察,初步筛选出了3个不同长径比的HA和5个不同水热温度下结晶度不同的HA进一步研究。随着HA晶粒的长径比增大,其蛋白吸附性能提高,但是释放Ca离子浓度较低,影响了细胞的成骨分化,因此球状的HA晶粒显著上调了细胞的成骨相关的基因表达;随着结晶度的提高,HA的蛋白吸附性能和离子释放性能下降,所以当水热温度为90℃时,所制备的HA具有较好的成骨活性。分别采用化学沉淀法、水热法以及化学沉淀法制备后热处理得到了Ca/P比梯度变化(1.5、1.55、1.6、1.67)的弱结晶HA,对比了制备方法、工艺以及Ca/P比对HA理化性能和细胞学性能的影响。结果显示:与化学沉淀法制备的HA相比,水热法制备的HA结晶度有所提高,形貌上以长棒状为主,且随其Ca/P增大而慢慢变短;化学沉淀法制备的HA经热处理后结晶度增加,且随着其Ca/P比增大更加明显,晶粒尺寸也有所增加,但是增加幅度随着其Ca/P比增大而降低。与化学沉淀法制备的HA相比,水热法制备的HA蛋白吸附性能有所增加,减小其Ca/P比可以进一步改善两者这一性能;化学沉淀法制备后热处理得到的HA蛋白吸附性能有所下降,但是随着Ca/P比增大,这一性能会得到改善。与化学沉淀法制备的HA相比,水热法制备的HA释放的Ca离子浓度有所下降,但是随着两者Ca/P比的增大,Ca离子释放浓度升高,而P的释放浓度下降;化学沉淀法制备后热处理得到的HA的离子释放浓度显著升高,而且随着其Ca/P比的增大而降低。采用化学沉淀法和水热法制备的Ca/P比为1.5的HA细胞增殖活性均比其他组要低;化学沉淀法制备后热处理得到的HA的细胞增殖活性没有明显差异,但是当Ca/P比为1.5时,其细胞增殖活性反而时最佳的;化学沉淀法制备的1.55Ca/P比弱结晶缺钙HA、水热法制备的1.6Ca/P比弱结晶缺钙HA和化学沉淀法制备后热处理的Ca/P比为1.55的弱结晶缺钙HA具备最佳的成骨活性。将Ca/P比为1.55的弱结晶缺钙HA进行等静压后低温烧结得到弱结晶缺钙纳米HA陶瓷,与常规高温烧结的高结晶度亚微米HA进行对比,结果显示:弱结晶度纳米HA陶瓷的力学强度明显不如高结晶度HA陶瓷,分别为38.8 MPa和69.5 MPa。但是前者具备更好蛋白吸附能力、降解速度,能够刺激促进干细胞多个成骨相关基因的表达。
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