肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，在我国占恶性肿瘤死亡的第二位。能够彻底清除肿瘤的外科手术切除是当前唯一可提供治愈机会的治疗手段。非手术疗法在HCC的处理中占有极其重要的地位。 微波、射频等热消融疗法能有效达到局部肿瘤灭活的目的，且具有微创、对肝功能损害小、可反复治疗的优点，已成为肝癌非外科治疗的主要手段。但是，局部热消融疗法仍难以避免肿瘤不断复发这一倾向性。如何有效预防热消融治疗后肿瘤不断复发是该领域的研究难点及热点，这一难题的解决将有利于大大改善HCC的预后，具有十分显著的临床意义。 随着人们对肿瘤免疫学认识的不断深入，建立肿瘤主动性免疫治疗模式可望成为解决肿瘤转移和复发的有效途径，其中以树突状细胞(Dendriticcells，DC)为基础的肿瘤免疫治疗是最有希望的模式之一。DC是人体内专职的抗原呈递细胞，表面表达丰富的MHCⅠ、Ⅱ类抗原、ICAM及B7-1、B7-2等共刺激分子，在获得并呈递抗原后会逐步成熟，直接激活同源静息的CD4+及CD8+T淋巴细胞，诱导特异性细胞毒T淋巴细胞，产生特异性细胞免疫应答。 热消融可以原位灭活肿瘤组织，在局部留下大量肿瘤抗原。在热消融局部加入未成熟DC在理论上可以增加局部DC数目的同时使之能在体内生理环境下有效地吞噬坏死的HCC细胞，并迅速成熟及呈递肿瘤抗原，进而有效地诱导T淋巴细胞产生特异性细胞毒T细胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)，彻底杀灭肿瘤及预防肿瘤的复发和转移，从而为解决如何预防HCC消融治疗后肿瘤复发及转移这一关键难题开辟一条崭新的途径。本研究在建立小鼠皮下肝癌模型的基础上，对肿瘤施行微波消融(microwaveablation，MWA)，尔后在灭活的肿瘤组织内注射小鼠未成熟DC，体内外观测MWA+DC诱导特异性抗肿瘤免疫效应。 第一部分小鼠骨髓树突状细胞的培养和鉴定 方法 1、小鼠DC的培养：无菌条件下取小鼠股骨、胫骨，冲洗骨髓腔获取骨髓细胞，以0.9％Tris-NH4CL裂解红细胞，PBS液洗涤3遍，用DC完全培养基(含10％胎牛血清，100u/ml的青霉素和100ug/ml的链霉素，2mML-谷氨酰胺，rmGM-CSF1000u/ml，rmIL-41000u/ml的RMPI1640)将细胞密度调节为106/ml后加入6孔板培养，每孔2ml，48小时后，吸去悬浮细胞，留下贴壁细胞再加入DC完全培养基，在37C、5％C02培养箱中培养，隔天换液，第6天收集。 2、光学显微镜观察DC的形态学变化。3、流式细胞仪(FACS)检测DC表型CD11c、CD86和CD80的表达。 结果 1、DC的形态学变化：从培养第48小时开始可见均匀散布的细胞克隆形成，随着时间延长，细胞克隆逐渐增大并且分散，至第6天，悬浮细胞明显增多，细胞分散悬浮，体积变大，形态不规则，有树枝状突起，呈现典型的DC形态。 2、DC表型鉴定：CD11c高表达(78.6±9.62))％，CD80和CD86低表达分别为(42.2±10.02)％和(30.0±18.74)％。 结论 在联合应用rmGM-CSF和rmIL-4的基础上，采用贴壁法可以从小鼠骨髓细胞诱导扩增大量的DC。第6天收集时主要是未成熟DC。 第二部分小鼠皮下肝癌微波消融 治疗方法 1.小鼠肝癌细胞株Hepa1-6的培养：用含20％灭活胎牛血清、100u/ml青霉素及100ug/ml链霉素、2mM的L-谷氨酰胺的DMEM培养基常规传代培养，收集对数生长期的细胞备用。 2.肝癌模型的建立：取6-8周龄雌性C57BL/6小鼠，单侧背部皮下接种Hepa1-6细胞悬液0.1ml(5x106细胞/鼠)。 3.用游标卡尺隔天测量其长径(a)和短径(b)，绘制肿瘤生长曲线，计算小鼠生存期。 4.肿瘤MWA：选取肿瘤直径达10mm的荷瘤小鼠，切开肿瘤周边皮肤及皮下，暴露肿瘤，沿肿瘤长轴插入微波电极对肿瘤进行消融，调整不同的能量输出条件，确定达到肿瘤基本灭活的消融条件。消融过程中测量瘤内及瘤旁组织的温度。 5.术后小鼠死亡率。 6.微波消融后肿瘤组织病理组织学检查。 结果 1.从接种第5天开始可触及肿瘤结节，肿瘤生长迅速，大约13天时直径就可达10mm，小鼠在50天内全部死亡，平均生存期为38天。 2.共消融33只小鼠，术后3天内死亡6只，其余的27只在2周内未死亡。因此认为术后3天内死亡与消融并发症有关，术后3天死亡率为18.2％。 3.MWA治疗后小鼠肿瘤变化曲线：Hepa1-6细胞接种后第13天，肿瘤长径达10mm，行MWA，肿瘤包块因炎症反应出现一过性增大，约3-4天后开始消退，后又因残留肿瘤组织复发，肿瘤继续增大。 4.MWA后肿瘤组织病理组织学检查：邻近消融电极的内部区域，肝癌细胞核维持原形态，酶活性消失；外部区域，酶活性减弱(温度为50℃左右)，细胞发生凝固性坏死。HE染色显示，内部区域在任何时间都维持原形态，外部区域消融后即刻成大片红染现象，48小时后有大量嗜中性粒细胞浸润，随着时间的延长逐渐纤维化被肉芽组织代替。 结论 MWA治疗小鼠皮下肝癌，能达到肿瘤绝大部分灭活的目的，为后续的免疫治疗研究提供一种可靠的动物模型。 第三部分小鼠皮下肝癌微波消融联合原位接种DC诱导特异性抗肝癌免疫 方法 1.小鼠皮下肝癌MWA后瘤内接种DC。 1.1实验分组：本实验共180只小鼠，皮下接种2周后选取合适的(皮下肿瘤、直径8-10mm)荷瘤鼠160只，随机分为对照组40只，DC组40只，MWA组80只。MWA组在MWA治疗后3天，存活66只，剔除肿瘤被咬破的9只，共剩余57只，随机再分为MWA+DC组29只，MWA+PBS组28只。即为以下四组： ①对照组：单纯荷瘤鼠 ②MWA+DC组：MWA后72小时瘤内多点注射未成熟DC，每次2x106/鼠/0.1ml，每周接种一次，共接种2次。 ③DC组：未行MWA治疗小鼠瘤内接种DC，接种方法同MWA+DC组。 ④MWA+PBS组：MWA后瘤内注射PBS0.1ml，接种方法同MWA+DC组。 1.2抗肿瘤免疫效应检测：肿瘤生长情况、肿瘤组织HE染色、免疫组化和免疫荧光法检测肿瘤组织内CD8+和CD4+T细胞的浸润、脾脏淋巴细胞对Hepa1-6的特异性杀伤活性。 1.3免疫保护效应检测：实验小鼠完成免疫治疗后2周，在存活鼠对侧背部皮下各接种Hepa1-65x106/鼠。观察 ①检测免疫效应：对侧肿瘤生长情况、对侧肿瘤组织病理学HE染色检查、免疫组化和免疫荧光检测肿瘤组织内CD8+和CD4+T细胞的浸润。 ②小鼠存活率。 2、DC归巢实验 2.1实验分组：每组取4只小鼠 ①对照组：单纯荷瘤②MWA+DC组：MWA后瘤内接种DC(MWA后72小时瘤内多点注射未成熟DC)③DC组：未MWA瘤内接种DC(与MWA+DC组同时同方式接种DC)④MWA+PBS组：MWA后瘤内注射PBS(与MWA+DC组同时接种PBS) 2.2PKH26红色荧光标记未成熟DC，MWA后72小时瘤内注射PKH26+DC2×106/鼠 2.3检测区域淋巴结PKH26-DC的存在情况。 瘤内注射DC24小时后处死小鼠，切取区域淋巴结，OCT包埋，冰冻切片，荧光显微镜计数PKH26-DC在淋巴结的分布。 2.4瘤内接种DC后一周收集引流淋巴结，分离淋巴结淋巴细胞与丝裂霉素处理过的过的肿瘤细胞共培养48小时，ELISA检测mIFN-γ的水平。 结果 1.MWA+DC组所有小鼠肿瘤完全消退，与其它组相比有显著差异(P＜0.05)。 2.MWA+DC组脾细胞对Hepa1-6细胞有特异性杀伤效能。在E/T=40和100时，MWA+DC组脾细胞对Hepa1-6细胞的杀伤力显著高于对照组、DC组、MWA+PBS组(P＜0.05)；对B16细胞的杀伤力各组均无显著性差异(P＞0.05)。 3.免疫组化及免疫荧光法显示MWA+DC组肿瘤组织内有大量的CD4+和CD8+T淋巴细胞浸润，显著高于其它三组(P＜0.05)。 4.MWA+DC组小鼠治疗后15周生存率显著优于对照组、DC组、MWA+PBS组，其生存率分别为0、23.6％、47.2％、84.8％。(P＜0.01)。 5.MWA+DC组可以抵御肝癌细胞再接种。所有未接种过治疗的小鼠(无治疗组)均出现了皮下肝癌结节。 6.PKH26与DC的融合率达100％；MWA+DC组小鼠肿瘤引流淋巴结内可见大量红色荧光，显著高于MWA+PBS组(P＜0.01)。 7.MWA+DC组mIFN-γ水平显著高于其他组(P＜0.01)。 结论 MWA后原位接种的未成熟DC通过迁移至区域淋巴结，诱导强而持久的特异性免疫应答反应，消除了MWA后肿瘤的局部复发，并能保护小鼠免受再接种的肿瘤细胞的攻击。。