研究背景卵巢癌发病率高,其早期患者症状不明显,治疗后复发率高、预后较差,且由于病理类型多样,机制及病因尚不明确。肌球蛋白重链9（MYH9）是广泛表达的细胞质肌球蛋白,研究发现MYH9在许多恶性实体肿瘤中均呈现高表达,MYH9高表达患者具有更差的生存期。MYH9可能在肿瘤细胞粘附、迁移、增殖和分化、上皮-间质转化（EMT）等过程中发挥着癌基因的作用。自噬依赖性铁死亡是近年发现的一种调节性细胞死亡的形式,具有高转移倾向的癌细胞特别容易受其影响,NRF2信号通路在其中起着重要作用,通过调节自噬依赖性铁死亡过程促使癌细胞死亡可能是抑制肿瘤生长的新思路。研究目的证明MYH9在卵巢癌细胞侵袭转移中发挥的作用,探索在卵巢癌中MYH9敲除与自噬依赖性铁死亡的关系,并进一步探讨其信号通路,探究MYH9是否可能成为卵巢癌治疗靶点。研究方法1.在公开数据库中探索MYH9与卵巢癌患者生存预后的关系。2.使用免疫组织化学法比较卵巢组织标本中MYH9的表达情况。3.使用实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹和免疫细胞化学法检测不同卵巢癌细胞中MYH9的表达差异。4.使用慢病毒转染,对MYH9高表达的卵巢癌细胞ES-2进行基因敲除,并用免疫荧光、实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法验证其感染效率。5.分别使用细胞周期及CCK8实验、平板克隆实验、流式细胞仪、Transwell小室、裸鼠皮下移植瘤模型,来检测转染后细胞在增殖能力、克隆形成能力、凋亡能力、体外迁移侵袭能力和成瘤能力的变化。6.使用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法检测细胞中上皮-间质转化（EMT）相关指标,讨论MYH9基因敲除对EMT进程的影响。7.使用透射电镜观察细胞超微结构的变化,初步探索MYH9基因敲除对自噬依赖性铁死亡的影响与基因表达的影响。8.使用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法检测MYH9基因敲除对铁死亡、自噬相关基因表达的影响,探索与NRF2相关信号通路的关系。研究结果1.公开数据库显示MYH9高表达的患者预后差。2.在mRNA水平和蛋白水平上,MYH9在四种不同卵巢癌细胞系中的表达情况为:ES-2＞SKOV-3＞CAOV-3＞OVCAR-3。3.转染后的ES-2 sgRNA细胞中,MYH9的表达明显降低,细胞增殖、克隆形成、侵袭迁移、体外成瘤能力均降低,细胞凋亡能力增加。4.MYH9 敲除后,卵巢癌细胞中 EMT相关指标ZEB1、N-cadherin、β-catenin、Vimentin、Slug和Snail表达量降低,E-cadherin表达量升高,EMT过程被抑制。5.电镜观察结果显示,ES-2sgRNA组的细胞及线粒体形态改变,自噬小体增多,同时发生自噬依赖性铁死亡。实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹实验也印证该结果,即MYH9基因敲除会促进自噬依赖性铁死亡。研究结论1.MYH9在人类卵巢癌组织中高表达,并与患者不良生存结局有关。2.MYH9基因敲除可抑制卵巢癌细胞体外迁移、侵袭、增殖、克隆形成、体外成瘤,并且抑制上皮-间质转化进程。3.MYH9可能靶向NRF2信号通路,抑制自噬依赖性铁死亡。