1研究目的:研究生命早期实施运动干预对心脏Nmnat基因RNAi、过量表达和定点突变中老龄果蝇心脏收缩功能、心脏节律、运动能力和生命周期的影响,探讨Nmnat的运动抗心脏衰老功能。2研究方法:W1118、NMNAT-RNAi(v107262)、NMNAT-HA(39702)、NMNAT-WR(39700)和NMNAT-H30A(39701)处女蝇分别与Hand-Gal4雄蝇杂交,收集F1代Hand-Gal4/+(nmnat基因正常表达果蝇),Hand>nmnat RNAi(nmnat基因敲减果蝇),Hand>nmnat-HA(nmnat基因过表达果蝇),Hand>nmnat-WR和Hand>nmnat-H30A(nmnat基因突变果蝇)处女蝇,随机分为:Hand-Gal4/+-C、Hand-Gal4/+-E、Hand>nmnat RNAi-C、Hand>nmnat RNAi-E、Hand>nmnat-HA-C、Hand>nmnat-HA-E、Hand>nmnat-WR-C、Hand>nmnat-WR-E、Hand>nmnat-H30A-C、Hand>nmnat-H30A-E,每组400只,每管20只,25℃恒温、50%恒湿、12小时昼/夜交替光照饲养。各运动组(E组)果蝇采用翻转运动,运动装置电机转速为0.5 r/s,于羽化后第2天实行连续3周,每周5d,每天2.5h翻转运动。运动装置从初始状态开始,以转轴为中心逆时针转动180°——停留16s——顺时针转动180°——停留16s,依此重复翻转诱导果蝇运动,训练时间为9:00-11:30。通过q RT-PCR技术检测7天龄Hand-Gal4/+-C组,Hand>nmnat-WR-C组,Hand>nmnat-H30A-C组,Hand>nmnat-HA-C组,Hand>nmnat RNAi-C组果蝇心脏Nmnat基因m RNA表达水平;应用M-mode心动图检测3周运动后(21天龄)和运动结束休息2周后(35天龄)果蝇心脏功能;采用攀爬指数评定于1周运动后次日及以后每周的第7天(直至7周龄)果蝇运动能力;各组于羽化后第1天随机取果蝇200只,相同条件饲养,培养基两天更换一次,同时记录果蝇死亡数,绘制存活曲线图,计算中位生存期。3研究结果3.1果蝇心脏Nmnat基因m RNA表达检测结果与Hand Gla4/+-C组相比,Hand>nmnat RNAi-C组、Hand>nmnat-HA-C组果蝇心脏Nmnat的相对表达量分别约有50%的下降和42%的上升(P<0.001,P<0.01);Hand>nmnat-WR-C组和Hand>nmnat-H30A-C组表达高于Hand Gla4/+-C组,其中Hand>nmnat-H30A-C组有显著性差异(P<0.05)。3.2果蝇心脏功能的M-mode心动图检测结果(1)3周龄果蝇心脏功能的M-mode心动图检测结果与Hand Gla4/+组相比,相同干预条件Hand>nmnat RNAi组FS下降(P<0.001),DD、SD增加(P<0.001);Hand>nmnat HA组、Hand>nmnat WR组、Hand>nmnat H30A组较相同干预条件Hand>nmnat RNAi组FS增加(P<0.001);与Hand>nmnat RNAi-C组相比,Hand>nmnat WR-C组SIAI下降(P<0.01)。与Hand>nmnat RNAi-C组相比,Hand>nmnat RNAi-E组果蝇FS增加(P<0.05);HandGla4/+-E组、Hand>nmnat HA-E组、Hand>nmnat WR-E组和Hand>nmnat H30A-E组较相同遗传背景C组FS增加(P>0.05);Hand>nmnat H30A-E组较Hand>nmnat RNAi-E组SIAI、AI下降(P<0.01,P>0.05)。(2)5周龄果蝇心脏功能的M-mode心动图检测结果与Hand Gla4/+组相比,相同干预条件Hand>nmnat RNAi组FS下降(P<0.001),DD、SD均增加(P<0.001);Hand>nmnat HA-C组、Hand>nmnat WR-C组和Hand>nmnat H30A-C组较Hand>nmnat RNAi-C组FS增加(P<0.05,P<0.001,P<0.001);与Hand>nmnat HA组相比,相同干预条件Hand>nmnat H30A组FS增加(P<0.05,P<0.01);与Hand Gla4/+-C组相比,Hand>nmnat RNAi-C组、Hand>nmnat HA-C组、Hand>nmnat H30A-C组AI增加(P>0.05),Hand>nmnat WR-C组AI下降(P>0.05);Hand>nmnat WR-C组、Hand>nmnat H30A-C组较Hand>nmnat HA-C组SIAI下降(P<0.001)。除Hand>nmnat HA组外,Hand Gla4/+-E组、Hand>nmnat RNAi-E组、Hand>nmnat WR-E组、Hand>nmnat H30A-E组较相同遗传背景C组果蝇FS增加(P>0.05);Hand>nmnat RNAi-E组、Hand>nmnat HA-E组、Hand>nmnat WR-E组、Hand>nmnat H30A-E组较相同遗传背景C组果蝇AI下降(P>0.05)。3.3随年龄增加果蝇攀爬指数检测结果随年龄增加,E组果蝇攀爬指数逐渐下降。从3周龄开始,C组果蝇随年龄增加攀爬指数逐渐下降。与1W-Hand Gla4/+-C组相比,1W-Hand Gla4/+-E攀爬指数增加;运动前2周,Hand>nmnat RNAi-E较Hand>nmnat RNAi-C攀爬指数升高;Hand>nmnat HA-E组在连续3周运动周较同龄Hand>nmnat HA-C组果蝇攀爬指数升高;随后周龄,Hand Gla4/+E组、Hand>nmnat RNAi-E组、Hand>nmnat HA-E组攀爬指数始终低于相同遗传背景C组。Hand>nmnat WR-E组和Hand>nmnat H30A-E组攀爬指数低于相同遗传背景C组。3.4果蝇生命周期检测结果与Hand Gla4/+-C组相比,Hand>nmnat WR-C组、Hand>nmnat H30A-C组存活曲线右移、上移;Hand>nmnat RNAi-C组较Hand Gla4/+-C组、Hand>nmnat HA-C组、Hand>nmnat WR-C组、Hand>nmnat H30A-C组存活曲线左移、下移,且中位生存期缩短(P<0.001);从第40天龄(6周龄)开始,Hand>nmnat WR-C组存活曲线较Hand>nmnat HA-C组右移、上移,且中位生存期延长(P<0.01)。与Hand Gla4/+-C组相比,Hand Gla4/+-E组中位生存期延长(P<0.05);与Hand>nmnat RNAi-C组相比,Hand>nmnat RNAi-E组存活曲线右移、上移,且中位生存期延长(P<0.01);与Hand>nmnat HA-C组相比,Hand>nmnat HA-E组中位生存期缩短(P<0.01);Hand>nmnat WR-C组、Hand>nmnat H30A-C组存活曲线较相同遗传背景E组变化不大。4结论4.1 Nmnat在维持心脏正常收缩功能和节律方面发挥重要作用。4.2较早年龄段运动能有效改善果蝇因Nmnat基因敲减引起的心脏收缩功能下降和收缩间期节律紊乱,且对心肌Nmnat基因敲减、过表达、失去酶活性的中老龄果蝇心脏收缩功能下降和心律失常有很好的减缓作用。4.3较早年龄段运动使Nmnat基因正常表达、Nmnat基因敲减、Nmnat基因过表达果蝇运动能力在生命早期有所提高,表现出Nmnat表达上调果蝇更高的运动适应性,而随年龄增加能量代谢下降导致运动效果减弱。4.4较早年龄段实行运动干预能有效延长Nmnat基因差异表达果蝇中位生存期,可能与运动上调果蝇体内NAD+水平延缓衰老进程有关。