研究背景:胰腺癌被认为是美国第四大癌症相关病因,且在我国有不断上升的趋势。该疾病的独特生物学使得在疾病发展的早期阶段很难被发现和诊断,并且很快死亡:总的五年生存率大约为6%(范围从2%到9%)。大多数胰腺癌患者在病情发展到晚期之前没有明显的症状。尽管生物标记物的检测可以帮助临床工作提高胰腺癌的可能性,但在临床实施前仍需要较大样本和严格的验证。手术切除被认为是治疗该病的第一选择,但只有不到20%的患者符合手术条件。尽管接受了可能治愈的切除术,但仍有大约70%-90%的患者最终会有全身性复发和晚期相关疾病。对于大多数胰腺癌患者,特别是那些局部晚期和转移性疾病患者,全身化疗是首选治疗方案。吉西他滨作为一种抗肿瘤药物,于1996年被批准作为胰腺癌的一线治疗药物。作为一种新的胞嘧啶核苷衍生物,它在进入人体内后由脱氧胞嘧啶激酶活化,由胞嘧啶核苷脱氨酶代谢。它主要作用于G1/S期,还能抑制核苷酸还原酶,导致细胞内脱氧核苷三磷酸酯减少,并且能抑制脱氧胞嘧啶脱氨酶减少细胞内代谢物的降解,具有自我增效的作用。经相关报道,吉西他滨在中位生存率和总生存率方面优于氟尿嘧啶(5-FU)。在1996年的一项随机对照试验(RCT)中,吉西他滨已成为胰腺癌局部晚期和转移患者的标准治疗方案。随后,一些研究建立了以吉西他滨为中心的联合疗法,如吉西他滨联合白蛋白紫杉醇、厄洛替尼、卡培他滨、氟尿嘧啶等。尽管对联合治疗方案的研究进展迅速,但总生存率和中位生存率的改善并不令人欣慰。近年来,研究方向已经开始瞄准复杂的FOLFIRINOX方案。在FOLFIRINOX方案中,三种药物的协同作用对76岁以下的患者提供了良好的性能状态,但同时药物毒性也相应增加。为了探索更多的治疗方案,美国和其他一些国家已经进行了许多临床试验,各种组合疗法可能在未来成为一种可能。热疗被认为是一种有效的辅助治疗方法,且已有几十年的研究经验。其非侵入性方法是将肿瘤组织的温度升高约41-42℃,并由此产生直接的细胞杀伤作用。由于不同肿瘤之间的微环境是不同的,不同细胞系之间的热剂量-反应关系可以产生自发的改变。热疗的机制可能是靶向细胞结构,如细胞膜、细胞骨架、大分子的合成等,并干扰它们的过程和功能,但仍需进一步研究。此外,热休克蛋白(HSP)等多种基因的表达也会受到热的影响。经相关报道,温和的热疗可以通过产生活性氧引起自噬性死亡来增强胃癌细胞的抗癌作用和化疗敏感性。另外,全身热疗可能有助于自然杀伤细胞(NK)和各种类型白介素(IL)和其他细胞因子的血浆水平的升高,这些细胞因子与机体免疫密切相关。根据这些特点,热疗结合多种不同的治疗方法,如化疗、手术、单克隆抗体和免疫疗法等,以获得更好的临床治疗效果。本文采用吉西他滨(盐酸吉西他滨)、热疗或吉西他滨联合热疗治疗胰腺癌细胞PANC-1,并从细胞增殖、细胞凋亡、ROS的形成及与肿瘤细胞凋亡、增殖和透明质酸生成相关蛋白的表达等方面分析三种治疗方法的抗肿瘤作用,以期探讨热疗对胰腺癌细胞作用的分子机制。目的:⑴检测吉西他滨和热疗治疗人胰腺癌细胞系PANC-1的效果及对细胞凋亡的影响;⑵分析比较三种治疗方法作用48小时和72小时后人胰腺癌细胞系PANC-1中抗凋亡蛋白的表达以及Caspase家族蛋白的表达情况,以此探究热疗诱导细胞凋亡可能的信号通路和机制。(3)初步探索PANC-1表面透明质酸合成酶和降解酶的表达情况,为靶向细胞间质的研究提供大致方向。方法:采用蜂巢式细胞培养皿培养人胰腺癌细胞系PANC-1,不同浓度的吉西他滨(5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)、热疗1小时及二者联用处理24、48、72小时后收集细胞爬片。采用MTT、H&E染色、流式细胞术等相关技术检测人胰腺癌细胞系PANC-1对三种治疗方法的反应的差异和ROS的产生;通过免疫细胞化学(ICC)、Western blot、TUNEL和免疫荧光等方法检测三种治疗方法处理后人胰腺癌细胞系PANC-1中抗凋亡蛋白、Caspase家族执行蛋白以及与肿瘤间质透明质酸表达高度相关的酶的表达情况。结果:(1)MTT结果显示,热疗增强化疗药物吉西他滨(以下简称化疗)对胰腺癌细胞系PANC-1细胞活力的抑制作用。单独化疗和热化疗的效果呈吉西他滨浓度梯度依赖性。(2)H&E染色结果发现,三种治疗方法处理的人胰腺癌细胞系PANC-1的形态发生不同程度的改变,细胞数目和密度有不同程度的减少。(3)流式细胞术检测结果表明,在暴露于化疗、热疗或热化疗后,活性氧48小时内在线粒体被有效激活。在48小时时间点之后,任何治疗组的ROS数量都急剧减少,提示化疗、热疗及热化疗在施用48小时后诱导活性氧物质产生的效果明显下降。在单独热疗、化疗或热化疗结合治疗组中,胰腺癌细胞都出现了不同程度的凋亡,且热化疗组的细胞凋亡比例和程度高于任何单独治疗组。(4)施用不同的治疗方案后,胰腺癌细胞中抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和肿瘤特异性凋亡抑制蛋白Survivin均表达下调,热化疗组下调更明显。信号传导及转录激活蛋白-3(signal transducer and activator of transcription-3,Stat-3)和半乳糖凝集素-1(Galectin-1)均有不同程度的表达下调,提示热疗可能与核内转录因子有关。此外,免疫荧光和Western blot的结果同时证明,含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)也参与到热疗促细胞凋亡的进程中。作为Caspase家族蛋白信号通路上的不同角色,Caspase-3,8,9在不同治疗方法中被有效激活。(4)透明质酸合成酶-2(HAS-2)与透明质酸降解酶-1(HYAL-1)的表达均有不同程度的改变,提示细胞间质透明质酸的含量和浓度也与肿瘤细胞表面酶的活性有关。结论:(1)热疗可以有效的在短时间内抑制胰腺癌细胞系PANC-1的细胞活力,但随时间此抑制作用逐渐减弱。综合治疗(热疗联合化疗)的效果要优于任何单一治疗方法。(2)热疗可以在较短时间内大量激活胞内ROS的产生并导致细胞凋亡,这种致凋亡方式在48小时后作用大幅减弱。(3)热疗可通过抑制抗凋亡蛋白Bcl-2,Survivin来促进胰腺癌细胞凋亡。(3)核内转录激活蛋白Stat-3和半乳糖凝集素Galectin-1也参与热疗促细胞凋亡的过程中。(4)另外,Caspase家族蛋白及相关通路也与热疗导致细胞凋亡部分相关,包括线粒体途径的Caspase-9和死亡受体途径的Caspase-8,最终由Caspase家族蛋白的执行蛋白Caspase-3执行细胞凋亡过程。(5)与透明质酸的生成高度相关的HAS-1与HYAL-1在施以热化疗之后均表达下降,提示肿瘤细胞PANC-1表面蛋白水平的变化可能影响细胞间质的结构组成。上述部分凋亡相关蛋白的异常表达可为热疗治疗胰腺癌提供新的探索可能性,并指导更深一步的临床治疗方向。