论文部分内容阅读
目的：多肽H-RN是来源于肝细胞生长因子Kringle1结构域的一个由11个氨基酸组成的肽段，其序列为RNPRGEEGGPW，我们在前面的研究中已经证实其具有体内外抗新生血管活性。本研究旨在对抗新生血管性多肽H-RN的抗炎效果进行系统性的研究和评价，并初步探究其抗炎机制研究。方法：1、多肽H-RN的体外抗炎有效性研究通过脂多糖（LPS）诱导小鼠巨噬细胞样细胞系RAW264.7来建立体外炎症模型，经多肽H-RN及其他药物处理，在进行细胞增殖试验的基础上检测炎性因子肿瘤坏死因子（TNF）-α和白介素（IL）-6的转录水平和表达水平的变化，并采用Transwell趋化实验研究H-RN对LPS诱导的RAW264.7细胞趋化作用的影响。由TNF-α刺激诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC）构建炎症模型，通过共聚焦显微镜观察H-RN对内皮-单核细胞粘附过程的影响，并检测TNF-α诱导的内皮细胞分泌粘附分子水平的变化。2、多肽H-RN的体内抗炎有效性研究采用LPS单次足垫注射法来构建大鼠内毒素诱导的葡萄膜炎（EIU）模型，通过单次玻璃体腔内给药对EIU大鼠以多肽H-RN或其他药物治疗，24小时后进行临床症状评分、房水中炎性细胞因子计数、蛋白定量、TNF-α和IL-6水平检测以及病理组织学评价。通过对Lewis大鼠皮下注射包含视网膜抗体R16的诱导剂免疫诱导实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）模型，在免疫后第6，9，12天，分别予以H-RN或其他药物玻璃体腔内注射治疗。免疫后的每天均对大鼠临床表现进行评分，在免疫后第14天取房水和眼内组织进行炎症因子TNF-α、IL-6和IFN-γ水平检测，并在第16天进行组织病理学评分。3、多肽H-RN的抗炎作用机制研究通过异硫氰酸荧光素（FITC）荧光标记多肽H-RN，在共聚焦显微镜下观测荧光多肽在细胞内的作用位点；应用免疫荧光手段检测H-RN对LPS诱导的NF-κB核转位的影响；并运用Western blot方法定量检测LPS诱导的NF-κB及其上游信号通路的PI3K-p85、AKT和IKK等因子的磷酸化水平变化。结果：1、多肽H-RN在体外的抗炎作用多肽H-RN及随机序列杂肽H-GP在浓度为50-500μM时均对RAW264.7和HUVEC细胞增殖活性没有影响。LPS刺激RAW264.7细胞24小时后，细胞上清液中炎症因子TNF-α和IL-6含量显著增高，而多肽H-RN在治疗浓度为100μM及以上时可在转录及翻译水平显著抑制炎症因子的含量，且表现出剂量依赖性，同时还可明显抑制LPS作为趋化因子介导的细胞迁移活动。另外，多肽H-RN在治疗浓度为100μM及以上时可显著减少由TNF-α诱导的单核细胞U937和内皮细胞HUVEC的粘附，并抑制粘附分子包括ICAM-1, VCAM-1和E-selectin的表达水平。2、多肽H-RN的体内抗炎作用多肽H-RN单次玻璃体腔内注射可以显著改善EIU临床表现评分，且有效抑制房水中炎性细胞和蛋白质的渗出并降低房水中TNF-α和IL-6的水平，在病理组织学方面也明显减轻了虹膜睫状体以及玻璃体视网膜的炎性细胞浸润。在EAU方面，自免疫后第6天起每三天一次玻璃体腔注射多肽H-RN，EAU的临床评分自第11天起显著降低；而眼内组织匀浆中IL-6的水平和房水中及组织匀浆中的IFN-γ的水平也得到明显的抑制；在组织病理切片中，多肽治疗组视网膜组织结构的破坏明显减轻，眼球后节浸润的炎症细胞显著减少。3、多肽H-RN的抗炎作用机制多肽H-RN通过吞噬泡样的结构进入细胞内，并抑制LPS诱导的PI3K p85亚基和AKT的磷酸化，从而抑制IKK复合物的活化，减少IκB的降解，抑制NF-κB的激活；免疫荧光实验结果也显示H-RN可抑制p65尤其是磷酸化的pp65向细胞核内转位。结论：1、体外有效性方面：多肽H-RN在转录和蛋白水平水平降低LPS诱导的RAW264.7细胞炎性因子的含量，并抑制细胞向LPS趋化迁移；同时，多肽H-RN可抑制TNF-α诱导的HUVEC粘附分子的水平，并阻止单核细胞与内皮细胞之间的粘附。2、体外有效性方面：多肽H-RN玻璃体腔内给药在临床症状、炎症因子和蛋白渗出以及组织病理学改变等方面对内毒素诱导的葡萄膜炎（EIU）和自身免疫性葡萄膜炎（EAU）均具有一定的疗效。3、机制研究方面：多肽H-RN抗炎作用的实现与PI3K-AKT-IKK-IκBα-NF-κB信号通路有关。