番石榴(P.guajava)是一种在民间传统医学中被广泛使用的桃金娘科药用植物,它的果实和叶子具有巨大的营养和药用价值。番石榴叶精油被证明具有抗弓形虫,治疗镇痛,缓解热应激,以及抑制核盘菌和杀蚊趋虫的功效,是一种潜在的药用资源并具有成为新型绿色农药的商用潜力。因此开发生态友好、低成本、易操作的精油提取技术成为研究热点。本课题使用红曲霉(Monascus anka)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)固态发酵番石榴叶,探究发酵过程中不同处理组的番石榴叶精油组分的动态变化;分析精油成分含量与关键水解酶活性变化的关系,探索固态发酵对番石榴叶精油释放的酶学机制;利用壳聚糖对发酵番石榴叶精油进行包埋,改善其不稳定、水溶性差的特性,同时增加缓控释效果并提高其体外生物活性。为发酵番石榴叶精油后续在不同领域中的开发和应用提供了理论基础。具体结论如下。红曲霉和巨大芽孢杆菌固态发酵对番石榴叶精油的影响:本实验所用江门产番石榴叶提取精油中包含33种化合物,其中总倍半萜含量高达92.62%。红曲霉和芽孢菌的发酵都不会改变番石榴叶精油组分中物质的结构,但红曲霉发酵对倍半萜的释放更为显著;巨大芽孢杆菌发酵对含氧倍半萜类和醛酮酸含氧脂肪族类化合物的释放更为显著;共发酵使得整个番石榴叶精油体系得到均匀释放,发酵第10天可达番石榴叶精油的最大总释放量5451.48μg/g,是未发酵样品的6.42倍,效果优于超声、微波、酶辅助和超临界提取技术。微生物对番石榴叶精油释放的酶学机制:两菌种分泌的11种关键水解酶在固态发酵对番石榴叶精油的释放中起着重要的作用。β-葡萄糖苷酶(r>0.990,p?<0.01)、内切葡聚糖酶(r>0.993,p?<0.01)和木聚糖酶(r>0.800,p?<0.01)是促使非挥发性芳香糖苷转化为游离挥发性化合物的主要酶;酯酶、蛋白酶、木质素降解酶和三种纤维素酶在破坏细胞结构释放挥发性芳香化合物中起着关键作用;两种过氧化物酶是使巨大芽孢杆菌在发酵过程中释放更多含氧类精油成分的原因;来自于巨大芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶由于含量太低所以与各成分释放都没有显著相关性。壳聚糖-发酵番石榴叶精油纳米粒的制备及表征:通过离子乳化交联法,用壳聚糖和三聚磷酸钠包埋发酵番石榴叶精油,以降低精油蒸发率,增加稳定性和水溶性为目的,制备出水合粒径、实际粒径、多分散指数和Zeta电位为150.8±0.2 nm～218.7±0.6 nm、43.90 nm～92.10 nm、0.231±0.002～0.252±0.002和27.4±0.1 m V～30.7±0.1 m V的壳聚糖-精油纳米粒,它们的包封率和载药量为9.90%±0.03%～20.30%±0.13%和4.83%±0.02%～9.01%±0.05%,并拥有12 h以上的缓释效果。保证精油纳米粒的基本溶液稳定性和体内透膜传递能力。其中,壳聚糖和精油质量比为1:0.50时合成的纳米粒具有最大的精油体外释放量5.30%。共发酵和纳米制剂的制备对番石榴叶精油体外生物活性的影响:共发酵第10天,虽与未发酵组相比DPPH自由基清除能力下降26.15%,但是ABTS+自由基清除能力、5-脂氧合酶和酪氨酸酶的抑制能力分别提高32.66%、18.73%和7.87%,综合来看两菌种的共发酵体系能改善番石榴叶精油抗氧化、抗炎和抑制黑色素的活性。此时精油的四种生物活性相应IC50分别达到21.47±1.95 mg/m L、20.47±2.49 mg/m L、23.21±1.92μg/m L和107.41±3.48μg/m L。壳聚糖精油纳米制剂的形式,又进一步将番石榴叶精油的这四种生物活性分别再次提高1.05、1.27、1.29和1.43倍。