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脂环酸芽孢杆菌可造成巴氏灭菌的果汁腐败,影响果汁的品质,引起国际的关注,已成为果汁国际贸易技术壁垒的新内容。国际贸易中严格要求每10 mL浓缩果汁中脂环酸算芽孢杆菌的含量小于1个。而我国在脂环酸芽孢杆菌分离、检测方法等方面的研究较少,且仅侧重于苹果汁中脂环酸芽孢杆菌的研究,对橙汁中脂环酸芽孢杆菌研究较少。因此,对橙汁与柑橘园中脂环酸芽孢杆菌的分离、鉴定与检测技术这对我国橙汁生产和贸易都具有十分重要的意义。本文以柑橘园及不同橙汁中分离得到的13株具有耐酸耐热性的菌株为研究材料,首先对其进行了菌落形态、培养基气味、耐酸性、耐热性、革兰氏染色等常规检测；随后对分离菌株进行了16S rDNA序列聚类分析；研究了分离菌株的16S rDNA PCR-RFLP限制性酶切特征图谱,并进行了聚类分析；此外,还根据脂环酸芽孢杆菌的16S rDNA设计了一对特异性强,灵敏度高的引物。具体研究结果如下：(1)选用BAT培养基在45℃2-5 d的培养条件,从橙汁及柑橘园中分别分离得到8株和2株脂环酸芽孢杆菌。因此,BAT培养基在45℃2-5 d的培养条件,可作为橙汁中脂环酸芽孢杆菌的选择性培养基。(2)本研究以分离菌株NFC-1为研究材料,对其生长曲线进行了研究,结果表明该菌经过18 h培养后进入对数生长期,在25 h菌体浓度能达到最高,随后进入稳定生长期。从而确定该菌的基因组DNA提取条件为：225 r／min 45℃气浴摇床培养25 h。(3)对13株分离菌与3种脂环酸芽孢杆菌标准菌的16S rDNA序列对比,并进行系统发育分析。结果表明,橙汁中8株具有耐酸耐热性的菌株均为脂环酸芽孢杆菌属,其中1株Alicyclobacillus acidiphilus DSM14558,3株Alicyclobacillus acidoteresstris DSM3922,4株A. acidocaldcular;柑橘园中有2株耐酸耐热菌为Alicyclobacillus acidiphilus DSM14558。(4)采用16S rDNA PCR-RFLP法对分离得到的13株耐酸耐热性菌株与3种脂环酸芽孢杆菌的标准菌进行聚类分析。结果表明,在87%的相似水平上,所有菌株分为5个种群和10个分支,其中P-1、P-5、K-1与标准菌A. acidiphilus DSM14558相似水平较高,可视为同一个种,即嗜热脂环酸芽孢杆菌；H-1、ZH-1、ZH-2与A.acidoterrestrius DSM3922相似水平较高,可视为同一个种,即酸土脂环酸芽孢杆菌；NFC-1、NFC-2、NFC-4、NFC-10另分一支,NFC-4号菌经克隆测序及序列比对,结果与嗜酸耐热菌中的A.acidocaldarus序列同源性高达99%以上,说明这4株菌均是酸热脂环酸芽孢杆菌。此外,16S rDNA PCR- RFLP聚类与16S rDNA序列分析聚类结果较为一致,由此说明本研究结果是可靠的。(5)根据16S rDNA属间的高变区,种间的保守区,设计出一对针对脂环酸芽孢杆菌的特异性强、灵敏度高的引物。通过优化试验,得到最佳扩增条件为：25μL扩增体系中,ddH2O 17.75μL,10xbuffer 2.5μL,25 mM Mg2+1.5μL, 10mM dNTP 1.5μL,35L0.3μL,35R 0.3μL,5U／ul Taq酶0.13μL,DNA模板1μL。扩增条件为：94℃5 min；94℃40 s,59.8℃40 s,72℃40 s,35个循环；72℃8 min。在最佳的扩增程序下,PCR扩增脂环酸芽孢杆菌的基因组DNA最低量为10-4pg,扩增脂环酸芽孢杆菌的最低菌液浓度为3.0×103CFU／mL。(6)成功建立了脂环酸芽孢杆菌的PCR快速检测方法。该方法的整体体系为：20 mL橙汁→80℃13 min→10 mL接种于BAT培养液→225 r／min 45℃的条件下气浴振荡培养25 h→采用CTAB法提取DNA→进行PCR扩增→琼脂糖电泳检测扩增产物→结果判断。整个检测过程约需要2-5 d,而传统常规检测过程约需要7-14d。