论文部分内容阅读
目的 探讨局部共转染肝细胞生长因子(hepatocyte growth facter，HGF)基因和血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)基因对大鼠自体移植静脉重塑的影响。自体静脉移植广泛用于旁路搭桥手术，用来治疗闭塞性冠状动脉和周围动脉疾病，但其5年和10年再狭窄发生率分别高达30％和50％。移植到动脉间的静脉段，暴露于高压力的动脉循环，其血管平滑肌细胞增生和新内膜形成导致管壁增厚，以此来适应高压力环境。这些增生的血管平滑肌细胞和同时出现的内皮细胞功能障碍，致使移植物的敏感性抬高，加速了其粥样硬化的进程。有资料报道，在移植静脉实验动物模型和人的临床样本，内皮细胞功能障碍包括内皮细胞一氧化氮合酶活性降低，血管反应能力下降，致炎细胞粘附分子表达增加。 HGF由二硫键连接的异二聚体分子组成，其中α重链含有kringle结构域，分子量为69-kDa，β轻链分子量为34-kDa，是一种新的具有多种潜能的治疗性生长因子(促进血管生成、创伤愈合和细胞存活)。有研究显示系统的给予人重组(hr)HGF用于调节肝、肾和肺疾病创伤愈合过程。近来的研究表明HGF是一种特殊的内皮细胞生长因子，具有保护血管或促进血管修复功能。HGF发挥作用时，首先结合于内皮细胞表面的HGF受体(c-Met)，再经细胞内Grb2、Grb1、PI3等信号途径发挥作用。这里，我们假设局部转基因，使该部HGF表达水平提高，可能促进移植静脉内皮细胞的增殖和修复，减少新生内膜的过度增生。血红素加氧酶是一种限速酶，催化血红素降解为一氧化碳(CO)、自由铁和胆绿素。血红素加氧酶-1(HO-1)是血红素加氧酶的诱导型同功酶，于体内和体外系统提供细胞保护作用。HO-1基因敲除鼠纤维母细胞培养显示，对血红素和过氧化氢介导的细胞毒性有高度敏感性。一系列证据强烈地提示血红素加氧酶在血管组织扮演着重要的生理和病理生理角色。HO一1基因转染至体外培养的冠状动脉内皮细胞，可以减少自由血红素的损害。最近的研究显示，药理性的调节HO一1过表达在大鼠颈动脉球囊损伤后的重塑过程中起重要作用，即系统的上调血管壁HO一1水平可显著地减少新生内膜的发展。HO一1催化血红素降解释放的CO，可能是HO一1起血管保护作用的重要传递介质。He而-cusJ等最近的研究显示，HO一1可能通过CO*cGMp叶PZlciPI途径将平滑肌细胞抑制在G0/Gl。 本研究是以腺病毒为载体，于自体移植静脉局部共转染HGF和Ho一1基因，有效的增加HGF和HO一1的mRNA和蛋白表达，促进移植静脉内皮细胞的增殖，抑制中膜和内膜平滑肌细胞的增生，最终达到抑制新生内膜增厚的目的。方法 1.用同源重组的方法，构成目的基因腺病毒重组体;以脂质体为转染介质，将目的基因腺病毒重组体转染到人胚肾细胞中进行包装，使病毒复性具有感染能力。 2.自体静脉移植模型为，将Wistar大鼠右颈总静脉部分切下后移植到腹主动脉。随机分为5组，即共转染(同时转染Ad一HGF和Ad一Ho一l)组、转染Ad一HGF组、转染Ad一HO一1组、对照病毒(Ad一GFP)组、磷酸缓冲液(PBS)处理组，每组分别于2、4、7、14、21、28天6个时间段切取标本。术中取约1.ocm右颈总静脉，经1%的肝素盐水冲洗，50协L处理液浸泡20分钟，开腹横断腹主动脉中部，将取好的静脉头尾端颠倒与腹主动脉近心端和远心端，外翻内膜后端端吻合。 3.利用荧光显微镜技术观察绿色荧光蛋白在移植血管的表达来测定转染率。应用RT一PCR和Westem Blot方法检测转染的hHGF和rHO一1基因在移植血管的表达。5一澳脱氧尿昔(B记U)免疫组织化学法观察移植血管内膜平滑肌细胞增殖;V汕。eff von Gieson一Masson三色染色测量移植血管内膜/中膜比率。 4.用原代培养的Wistar大鼠腹主动脉血管平滑肌细胞(vaseular smoothmuscle eells，VSMCs)。将平滑肌细胞与不同滴度的Ad一HO一1、对照病毒(Ad一GFP)在体外共同培养。用RT一PCR法检测HO一lmRNA、解7mRNA的表达;用Westem一blot法检测HO一1、衅7蛋白表达;用流式细胞技术检测平滑肌细胞周期。结果 1.制备了高病毒滴度的肝细胞生长因子基因腺病毒重组体和血红素加氧酶一l基因腺病毒重组体。 2.(1).共转染组、转染Ad一HGF组、转染Ad一HO一1组、对照病毒Ad一GFP组绿色荧光蛋白表达于移植后第1一21天均可见，PBs处理组无绿色荧光蛋白表达。(2).移植后第14天HGFmRNA的表达，共转染组与转染Ad一HGF组相比较，二者无显著性差异(P>0.05);二者与转染Ad-HO一1组、对照病毒 Ad一GFP组和PBS处理组比较，有著性差异(P<0.05)。移植后第14天HO一lmRNA表达，共转染组与转染Ad一HO一1组相比较，二者无显著性差异(P>0.05);二者与转染Ad一HGF组、对照病毒Ad一CFP组和PBS处理组比较，有著性差异(P<0.05)。移植后第14天HGF蛋白的表达，共转染组与转染Ad一HGF组相比较，二者无显著性差异(P>0.05);二者与转染Ad一HO一1组、对照病毒Ad一GFP组和PBS处理组比较，HGF蛋白表达有著性差异(P<0.05)。移植后第14天HO一1蛋白的表达，共转染组与转染Ad一HO一l组相比较，二者无显著性差异(P>0