利用GroEL基因和dsRNA介导的转基因番茄抗TYLCV的研究

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番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)是江苏省主要蔬菜作物,在蔬菜周年供应中占有很重要的地位。然而近年来,番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的发生,对番茄植株的生长、开花、坐果等方面产生了严重的危害,严重影响了番茄生产的品质和产量,给番茄产区的生产造成了巨大了损失。   番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)属于双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus),并通过烟粉虱(Bemisia tobaci)传播。目前国内开展抗TYLCV的研究时间尚短,可用的抗源有限。由于TYLCV不同物种间的遗传隔离、病毒重组变异引起的双生病毒基因组多样性以及抗源在不同地区的表现差异,使抗病育种受到了极大限制。因此在利用常规技术和生物技术进行发病规律、抗病机理和抗源筛选研究的同时,本实验利用转基因手段,希望获得抗TYLCV的番茄材料。   本实验利用烟粉虱内共生菌GroEL基因构建了具有抗生素标记的SUC2-GroEL和无抗生素标记的CaMV35S-PDRB10两个植物表达载体,同时还利用番茄黄化曲叶病毒的AC1(replication-relate)和AC2(movement)基因构建了反向重复序列表达载体。经农杆菌介导法转化番茄,对转基因番茄进行了抗病研究,研究结果如下:   1.具有抗生素标记的SUC2-GroEL和无抗生素标记的CaMV35S-PDRB10两个植物表达载体经农杆菌介导法转化获得抗性再生苗。对抗性植株进行PCR、RT-PCR以及病毒检测,PCR结果表明:SUC2-GroEL载体和CaMV35S-PDRB1O载体的阳性植株分别有11株和9株。RT-PCR结果显示:SUC2-GroEL载体和CaMV35S-PDRB10载体分别有6株和2株检测到GroEL基因特异条带,说明GroEL基因在转录水平得到表达。经农杆菌病毒接种和带毒烟粉虱传毒检测后,结果显示SUC2-GroEL载体的3、4和5号植株和CaMV35S-PDRB10载体的5号植株均未表现发病症状,证明利用GroEL基因抗番茄黄化曲叶病毒具有可行性,而且SUC2启动子诱导的GroEL抗性更加理想。   2.利用TYLCV的AC1(replication-relate)和AC2(movement)基因构建了反向重复序列植物表达载体pBI121-AC1-AC2经农杆菌转化导入番茄,获得再生植株。经PCR、注射接种和烟粉虱传毒实验检测,PCR检测显示:获得13株阳性植株,表明目的基因已经整合到番茄基因组DNA中。进一步进行病毒检测初步获得3株抗TYLCV的转基因植株。
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