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产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxin Escherichia coli,ETEC)是引起幼畜腹泻的主要病原之一,给畜牧业生产尤其是养猪业造成了巨大的经济损失。研究表明, K88ac、K99菌毛和ST肠毒素是产肠毒素性大肠杆菌主要的致病因子,它们在幼畜腹泻疫苗研制中具有重要的作用。根据公布的产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxin Escherichia coli,ETEC)的K99菌毛抗原的核苷酸序列(序列号:M35282)。设计特异性引物,通过PCR扩增得到K99菌毛抗原成熟肽基因,回收纯化后将K99基因连于克隆载体pBS-T上,通过PCR、酶切鉴定、测序,证明其中含有K99基因片段,命名为pBS-K99。将鉴定结果正确的重组质粒和原核表达载体质粒pET-28a用XhoI/NcoI分别双酶切,通过T4DNA连接酶将目的基因片段克隆入表达载体中,转化入BL21(DE3)大肠杆菌中,经IPTG诱导进行蛋白表达,SDS-PAGE、Western blotting检测所表达的蛋白。本研究在构建重组菌株BL21(DE3)(pET-28a-K99)和BL21(DE3)(pET28a-K88ac-STⅡ)的基础之上进一步作下述研究:采用IPTG诱导法分别对重组菌株BL21(DE3)(pET28a-K88ac-STⅡ)和BL21(DE3)(pET-28a-K99)进行诱导培养。SDS-PAGE凝胶电泳分析,重组菌株分别在约30KDa和18KDa处有特异性表达的蛋白条带,与预期分子量大小一致。在表达蛋白鉴定的基础之上,通过透析的方法对目标蛋白进行初步纯化回收。重复跑SDS-PAGE凝胶,切取目标蛋白条带将其装入特定孔径大小的透析袋中继续水平电泳,使得目标蛋白从凝胶中跑出,透析过夜后用PEG 6000调整定量蛋白的浓度约为3mg/mL,加入弗氏不完全佐剂作为重组蛋白疫苗。分别以重组蛋白疫苗、商品疫苗和PBS免疫仔猪,优化检测免疫抗体水平的间接ELISA条件,通过比较三个免疫组的抗体水平来评价表达蛋白作为免疫抗原的有效性。经IPTG诱导重组菌株BL21(DE3)(pET-28a-K99)进行蛋白表达,经SDS-PAGE分析,结果表明:所表达的蛋白表达产物分子量大小为18KDa,且表达量较高,表达蛋白经Western blotting检测表明:表达的K99蛋白能和ETEC(C83912)免疫的兔血清发生特异性结合,证明其具有反应原性。以重组蛋白疫苗、商品疫苗和PBS免疫仔猪,结果表明:重组蛋白免疫组、商品疫苗免疫组与PBS对照组抗体水平差异极显著(P<0.01),重组蛋白免疫组和商品疫苗免疫组抗体水平差异不显著(P > 0.05)。