微小RNA-7（miR-7）在非小细胞肺癌（NSCLC）发生中具有重要调控作用,是潜在治疗新靶点,但干预效应亟待改善。新近研究显示,间歇性禁食（IF）可改善包括化疗、免疫生物治疗等效应,然而,其是否可改善NSCLC的基因治疗效应还未有研究报道。本研究拟观察IF是否可增强miR-7对人NSCLC细胞生长的干预效应,并探讨其相关分子机制。本课题研究内容包括三部分,分述如下:目的:第一部分:通过克隆形成、流式细胞术、Real-time PCR、Western Blot等实验为观察IF联合miR-7对人非小细胞肺癌（NSCLC）细胞体外生长的影响。第二部分:通过常规建立人NSCLC裸鼠移植瘤模型,为观察IF联合miR-7对人NSCLC细胞体内生长的影响。第三部分:通过利用RNA-seq、Real-time PCR和Western Blot等技术,结合分子克隆、过表达技术及EMSA实验等探讨IF联合miR-7影响人NSCLC细胞生长的分子机制。方法:第一部分:将体外实验分为4组,分别为:对照组（G1组）、IF处理组（G2组）、miR-7基因干预组（G3组）和IF联合miR-7基因干预组（G4组）,其中,禁食采用两轮常规16:8小时间歇性禁食方案,miR-7基因干预采用体外瞬时转染p-T-miR-7真核表达质粒载体方式1次。CCK-8法及克隆形成实验分别检测各组人NSCLC细胞的增殖以及细胞克隆能力;流式细胞术检测细胞周期的变化情况;免疫荧光检测细胞Ki-67的表达;Real-time PCR检测miR-7及与肿瘤细胞生长周期相关的蛋白依赖性激酶CDK1,CDK2,CDK4和CDK6的表达变化;最后,利用Western Blot技术检测生长相关蛋白CDK1,CDK4,CDK6,cyclin A1,cyclin B1,cyclin D1以及相关信号途径变化情况。第二部分:建立人NSCLC裸鼠移植瘤模型。将模型小鼠随机分为4组（n=4）,分别为:对照组（G1组）、IF处理组（G2组）、miR-7基因干预组（G3组）和IF联合miR-7基因干预组（G4组）,其中,IF处理组采用9轮间歇性禁食（16:8方案）,miR-7基因干预采取每隔3天给模型小鼠于肿瘤原位注射p-T-miR-7重组质粒（12.5μg）1次,连续注射3次;实验期间在每轮禁食前后监测各组小鼠体重变化情况,并每3天测量肿瘤大小。于第9轮间歇性禁食5天后,常规处死模型小鼠,并收集其肿瘤组织及各主要脏器（包括心,肝,脾,肺,肾,脑,肠）,比较分析各组小鼠这些主要脏器重量及脏器指数变化情况,并通过HE染色观察其组织形态学变化情况;采集小鼠眼球血用于检测各组小鼠总胆固醇（TC）,甘油三酯（TG）,血糖（GLU）以及谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）,尿素（Urea）,肌酐（Cr）,白蛋白（ALB）等生化指标水平的变化情况;免疫荧光检测肿瘤组织中增殖核抗原Ki-67蛋白的表达情况;提取并纯化肿瘤组织及各主要脏器DNA并通过Real-time PCR检测计算各脏器质粒拷贝数分布情况;Real-time PCR和原位杂交（FISH）检测肿瘤组织中miR-7的表达;此外,Real-time PCR检测肿瘤细胞生长周期相关的蛋白依赖性激酶CDK1,CDK2,CDK4和CDK6的表达变化;最后,利用Western Blot检测相关信号途径的变化情况。第三部分:Trizol法抽提上述实验中的肿瘤细胞/组织RNA,送RNA-seq检测,通过KEGG、GO和韦恩分析筛选出差异信号通路,进一步在差异信号通路中筛选出差异下调基因;通过Target Scan数据库筛选出这些下调基因中miR-7可能作用的靶分子,最终选定miR-7的候选靶分子,并用Western Blot和免疫荧光验证其表达;进一步通过分子克隆技术构建过表达靶分子的真核载体;利用Lipo3000纳米阳离子脂质体将p-TmiR-7和p-靶分子过表达质粒在体外瞬时共转染人A549细胞,通过CCK-8实验检测共转染后细胞增殖能力的变化;免疫荧光检测细胞增殖指标EdU的表达情况;此外,利用Real-time PCR检测肿瘤细胞中靶分子、生长周期相关蛋白依赖性激酶CDK1,CDK2,CDK4和CDK6的表达变化;最后,利用Western Blot技术检测与生长相关的蛋白CDK1,CDK4,CDK6,Cyclin A1,Cyclin B1和Cyclin D1以及Ras,p-Raf,p-Erk,p-Akt等相关信号途径分子的表达变化情况。结果:第一部分:CCK8和克隆形成实验结果显示:与G1组相比,G3组人A549细胞增殖和克隆形成能力显著降低（P＜0.05）,与我们前期实验一致;尽管与G3组相比没有差异（P＞0.05）,但与G1组相比,G2组A549细胞增殖和克隆形成也显著降低（P＜0.05）;重要的是,与G1、G2和G3组相比,G4组人A549细胞增殖和克隆形成均显著降低（P＜0.05）;FACS检测结果进一步显示:与G1、G2和G3组相比,G4组人A549细胞G0/G1期比例上调（P＜0.05）,S期比例下调（P＜0.05）,G2/M期比例下调（P＜0.05）;类似地,免疫荧光和Real-time PCR检测结果显示:与G1、G2和G3组相比,G4组人A549细胞Ki-67表达和细胞生长周期相关蛋白依赖性激酶CDK1和CDK6表达均明显下调（P＜0.05）;此外,Western Blot结果显示:与其他各组相比,G4组人A549细胞生长相关蛋白CDK1,CDK6,cyclin A1,cyclin B1表达水平明显下调（P＜0.05）,与Real-time PCR结果一致。第二部分:与G1组相比,G2和G3组荷瘤裸鼠肿瘤生长均明显减缓（P＜0.05）,与我们前面体外实验结果相似;但与G1、G2和G3组相比,G4组荷瘤裸鼠肿瘤生长受到显著抑制（P＜0.05）;肺组织HE染色结果显示:G1组荷瘤裸鼠肺部可见明显的肿瘤细胞肺转移,而与G1组相比,G2组和G3组肿瘤肺转移减少（P＜0.05）;重要的是,G4组未观察到明显的肿瘤肺转移灶（P＜0.05）;肿瘤组织HE染色结果显示:与G1、G2和G3组相比,G4组肿瘤局部细胞形态不规则,可见大面积肿瘤坏死区域;主要脏器HE染色结果显示:与G1组相比,G3组模型小鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏、脑和肠组织无明显病理学改变;然而,与G1组和G3组相比,G2和G4组模型小鼠肝脏、脾脏、肾脏、脑组织存在轻微的炎性细胞浸润;质粒拷贝数检测结果显示:与其它各脏器相比,G3和G4组模型小鼠肿瘤组织质粒均高表达,但两组间并无明显统计学差异;而在肺组织和脑组织中,G3和G4组质粒分布均高于其他脏器,但两组间并无明显统计学差异。Real-time PCR检测结果进一步显示:与G1、G2和G3组相比,G4组肿瘤组织中miR-7的表达显著上调（P＜0.05）,而与G3组相比,G4组模型小鼠的心、肺、脑组织中miR-7的表达也明显上调（P＜0.05）;原位杂交结果显示:G4组中miR-7的表达与其他各组相比显著上调（P＜0.05）,与Real-time PCR结果一致;此外,与G1、G2和G3组相比,G4组模型小鼠肿瘤组织细胞生长周期相关蛋白依赖性激酶CDK1,CDK2和CDK6的表达明显下调（P＜0.05）。最后,各组模型小鼠的上述重要脏器的重量和脏器指数均无明显差异（P＞0.05）;同时,血生化检测结果显示:各组模型小鼠血清中TC,TG,GLU,AST,ALT,Urea,Cr和ALB等指标的水平均无显著差异（P＞0.05）。第三部分:RNA-seq测序结果分析显示:体内外G4组与其他三组相比时,均能富集出MAPK和PI3K/Akt两条信号通路。聚类分析进一步显示:包括:成纤维细胞生长因子受体4（fibroblast growth factor,FGFR4）、丝裂原激活蛋白激酶激酶6（Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase 6,MAP2K6）、Erb-B2受体酪氨酸酸激酶3,（Erb-B2 Receptor Tyrosine Kinase 3,ERBB3）、胰岛素样生长因子受体（Insulinlike growth factor 1 receptor,IGF1R）、脊髓发育不良综合征相关蛋白1（Myelodysplasia Syndrome-Associated Protein 1,别名MECOM）、胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate,IRS1）及EPH相关受体酪氨酸激酶配体7（亦称Ephrin A5,EFNA5）等相关分子明显下调,其中以miR-7的靶分子IGF1R在G4组下调最为显著。Western Blot和免疫荧光实验验证得到相一致的结果。免疫荧光结果显示:肿瘤细胞/组织中,随着IGF1R表达水平降低,细胞增殖指标Ki-67以及p-Erk分子的表达均显著下调（P＜0.05）。此外,Western Blot结果显示:与其他各组相比,G4组肿瘤细胞/组织中MAPK信号通路分子,包括Ras,p-Raf,p-Erk以及PI3K信号通路分子p-Akt等表达水平均明显降低（P＜0.05）,与测序分析结果相一致;CCK8实验和EdU检测结果显示:与联合干预组相比,间歇性禁食联合p-IGF1R/p-T-miR-7质粒共转染组肿瘤细胞生长明显增强（P＜0.05）;Western blot结果进一步显示:细胞周期相关蛋白CDK1,CDK4,CDK6,cyclin A1,cyclin B1,cyclin D1表达,以及MAPK信号通路分子,包括p-Raf,p-Erk以及PI3K信号通路分子p-Akt等表达水平均明显增加（P＜0.05）。最后,Real-time PCR结果显示:与其余各组相比,G4组中ciRS-7、cyrano的表达水平均无显著差异（P＞0.05）;生物信息学分析显示转录因子CREB3、ATF3是结合TTF-1启动子的潜在转录因子;Western blot结果显示:与其余各组相比,G4组中ATF3的表达水平明显增加（P＜0.05）,与RNA-seq结果相一致,而CREB3在四组中的表达水平并无明显差异（P＞0.05）;同时,免疫荧光检测各组ATF3表达得到与Western blot相一致的结果;最后,EMSA实验结果显示:ATF3能够与TTF-1的启动子结合,提示ATF3可能是调控联合干预中miR-7上调表达的重要因子。结论:1.IF联合miR-7干预更有效地抑制人NSCLC细胞的体内、外生长,机制与IF上调转录因子ATF3水平提高了TTF-1启动子活性从而增强miR-7表达,进而抑制其靶分子IGF1R及其相关信号通路有关。2.IF对模型动物部分脏器存在一定潜在影响。