机体的抗肿瘤免疫效应机制包括细胞免疫和体液免疫两个方面，T细胞主导细胞免疫功能，是机体免疫对抗肿瘤的主力。有证据显示肿瘤可以导致外周T细胞功能严重受损，降低循环T细胞的反应性从而导致机体免疫抑制。在膀胱癌动物模型中，外周血中T淋巴细胞数量减少，尤其是在肿瘤组织T淋巴细胞数目减少更加明显。也是膀胱癌肿瘤免疫逃逸的主要机制之一。所以研究膀胱癌T淋巴细胞免疫功能抑制机制，找到其免疫功能恢复的方法，对膀胱癌的预防和治疗有重要理论及临床意义。　　 胸腺是人体重要的免疫器官，是T淋巴细胞发育成熟的场所，在肿瘤免疫中起重要的作用。自骨髓的淋巴细胞祖细胞在胸腺中与胸腺基质细胞形成的胸腺微环境相互作用分化、发育、成熟最终形成T淋巴细胞。在这个过程中胸腺基质细胞为胸腺细胞的发育提供有力的环境支持。胸腺上皮细胞又可分为皮质上皮细胞和髓质上皮细胞。多种肿瘤导致胸腺萎缩现象逐渐受到关注，以腺体变小、重量减少为主要特征，同时胸腺发育相关基因如IL-7，IL-15等也表达下降。胸腺萎缩则影响T淋巴细胞发育，造成外周淋巴组织中T淋巴细胞质与量的异常。胸腺萎缩可直接影响细胞免疫，进而影响到肿瘤免疫。然而，是来源于骨髓的淋巴细胞祖细胞功能障碍还是胸腺微环境破坏导致的T淋巴细胞功能异常尚无定论。在很多疾病模型中，KGF通过增加TEC数量以及恢复胸腺皮质和髓质结构恢复胸腺的功能，提高了胸腺的输出能力进而发挥增强机体免疫力的作用。以上研究提示骨髓来源的T淋巴细胞祖细胞在机体免疫功能低下时其功能相对稳定，而良好的胸腺微环境是决定T淋巴细胞发育成熟，行使其免疫功能的关键。　　 综上所述，我们希望通过建立MB49膀胱癌小鼠模型，1、通过检测免疫器官胸腺发育相关基因转录水平，相关细胞因子的分泌及T淋巴细胞发育时相改变从而探讨膀胱癌肿瘤免疫抑制发生的具体机制;2、研究膀胱癌小鼠KGF处理后，免疫功能回复状态。通过本课题的研究可了解膀胱癌免疫抑制的分子机制，为膀胱癌的预防及治疗提供理论基础。　　 材料和方法：　　 一、实验动物与分组实验选用SPF级C57BL/6小鼠8-12周龄、雌雄各半。动物被单独安置在SPF级环境内。所有动物的使用均在中国医科大学实验动物研究中心进行，按实验室研究中心使用动物指南操作，符合动物使用的制度。　　 MB49细胞系获赠于中国医科大学免疫学教研室吕昌龙教授，于DMEM中加10％小牛血清，1％青霉素/链霉素培养，传代。离心，制成1*10^6个/0.1 ml悬液。SPF级C57BL/6小鼠分为:对照组;肿瘤组;KGF注射肿瘤组;KGF注射肿瘤对照组对照组:模型实验时同时无菌麻醉同龄的同性别的C57BL/6鼠，常规消毒后，取小鼠颈背部皮肤，皮下注射NS0.1ml。置于SPF级环境内，单只分笼饲养4～6周后取材检验。　　 肿瘤种植实验组:10％的水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射。常规消毒后，取小鼠颈背部皮肤，皮下注射MB49细胞，1*10^6。术后，置于SPF级环境内，单只分笼饲养4～6周后取材检验。　　 KGF注射肿瘤组:取肿瘤荷瘤小鼠在肿瘤植入后两周后，每天尾静脉5mg/kg注射KGF。共一周，注射完毕后，三天后取材检验。　　 KGF注射对照组:荷瘤小鼠在肿瘤植入后两周后，每天尾静脉5mg/kg注射NS。共一周，注射完毕后，三天后取材检验。　　 二、标本的采集和处理C57BL/6小鼠各组，给予10％水合氯醛0.3ml/kg腹腔注射麻醉，剖腹、腹主动脉取外周血，分离出胸1、组织病理学分析C57BL/6小鼠各组，给予10％水合氯醛0.3ml/kg腹腔注射麻醉，剖腹，取胸腺，石蜡固定，HE染色，切片，光镜下分析。　　 2、胸腺发育相关基因检测C57BL/6小鼠各组，给予10％水合氯醛0.3ml/kg腹腔注射麻醉，剖腹，取胸腺，提取RNA，合成cDNA。采用SYBR Green I荧光染料嵌合法，分别扩增目的基因(Foxnl、IL-7、LM02 mRNA)和管家基因(GAPDH)。使用Real-time PCR法进行检测。　　 3、胸腺细胞及及胸腺基质细胞获取与流式细胞检测(1) C57BL/6小鼠各组，给予10％水合氯醛0.3ml/kg腹腔注射麻醉，剖腹，取胸腺及脾脏。　　 (2)Ⅰ(Roche Diagnostics)混合物的1640培养基中处理10分钟，振荡2-3次。收集细胞，离心，过滤，抗体孵育。在冷PBS中撕破胸腺被膜并振荡数次去除胸腺内的淋巴细胞。然后放入DMEM培养基中在4℃继续搅拌1h。进一步用含有5U/mlDNase I的1 mg/ml胶原酶Ⅳ(Roche) DMEM溶液在37℃消化10分钟，振荡2-3次。此步骤可以重复1-2次直到所有组织被溶解。溶解的细胞，用大鼠抗小鼠CD45抗体染色，再和结合有抗大鼠IgG的免疫磁珠反应，所获得的细胞磁架收集，不吸附于磁架的细胞为胸腺上皮细胞。收集细胞，离心，过滤，抗体孵育。　　 (3)脾脏组织在含有0.125％胶原酶D(Roche Diagnostics)，0.1％ Dnase I(RocheDiagnostics)混合物的1640培养基中被研磨碎。收集细胞，离心，过滤，抗体孵育。　　 (4)肿瘤小鼠与对照组小鼠FACS分析外周功能性T淋巴细胞分布检测，脾脏CD8+及CD4+T淋巴细胞分析;外周效应T淋巴细胞检测CD62+及CD44+T淋巴细胞分析。总上机细胞数为100，000至500，000个。　　 (6)增殖及凋亡检测。使用Annexin V试剂盒及EdU试剂盒参照说明书分别检测T细胞及TEC的增殖及凋亡。　　 4、TREC检测新鲜外周血在分离出单个核细胞后提取DNA于-20℃保存，肿瘤小鼠与对照组小鼠Real-time PCR绝对定量检测C57BL/6外周血单个核细胞中sjTRECs含量变化。根据标准曲线和样本PCR反应Ct值得出样本TREC和RAG2拷贝数，由{（TREC拷贝数1+TREC拷贝数2）/（RAG2拷贝数1+RAG2拷贝数2）}*2000，000.公式可以得到1000，000个细胞数中TREC拷贝数。　　 三、统计学分析实验数据采用x±s表示，实验原始数据采用SPSS17.0软件统计分析，组间比较采用t检验，组内比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两变量相关分析采用Pearson相关分析，P＜0.05差异具有显著意义，P＜0.01差异具有极显著意义。　　 结果：　　 一、MB49细胞移植可建立C57小鼠膀胱癌模型。　　 二、荷瘤小鼠与正常小鼠对比1、荷瘤小鼠胸腺体积萎缩，重量减轻。细胞计数减少。差异显著(P＜0.05)。　　 2、Foxnl、KGF、Foxp3，IL-7mRNA在荷瘤小鼠中表达降低，差异显著(P＜0.05)。　　 3、采用CD4，CD8，CD44，CD62L单克隆荧光抗体标记小鼠胸腺、脾脏的T淋巴细胞亚群进行流式细胞分析表明:　　 (1) C57BL/6小鼠脾脏CD4+和CD8+细胞中，na?ve CD4+细胞和na?ve CD8+细胞的百分含量在肿瘤小鼠减少，差异显著(P＜0.05);而E/M CD4+细胞和E/M CD8+细胞的百分含量在肿瘤小鼠增多，差异显著(P＜0.05)。　　 (2)淋巴细胞亚群检测提示荷瘤小鼠淋巴细胞发育迟缓。　　 (3)荷瘤小鼠TEC及T细胞凋亡增多。增值减少。差异显著(P＜0.05)(4)T细胞DNA受体删除环(TREC)鉴定胸腺输出功能，肿瘤小鼠低下。差异有显著意义。　　 三、KGF注射对于荷瘤小鼠T细胞功能回复比较：　　 1、注射KGF组小鼠胸腺体积较未注射组增加，重量增加;细胞数增加。T淋巴细胞亚群分布趋于正常(P＜0.05)。　　 2、KGF治疗组小鼠TEC细胞增殖增加。差异显著(P＜0.05)。KGF治疗小鼠的外周T细胞亚群正常分布的回复，T细胞DNA受体删除环（TREC）鉴定胸腺输出功能有所恢复(P＜0.05)。　　 3、KGF治疗组小鼠生存时间延长，肿瘤重量缩小(P＜0.05)。　　 结论：　　 肿瘤导致机体免疫抑制过程中，胸腺微环境随肿瘤发生的退行性改变是导致T淋巴细胞发育障碍，功能受损的主要原因。小鼠KGF模型成功的建立，重塑了荷瘤鼠的幼稚T细胞池，论证了新建胸腺微环境良好地代偿了宿主萎缩胸腺的功能，进而说明肿瘤鼠的来源于骨髓的淋巴干细胞没有先于胸腺基质发生功能抑制。目前激活自身免疫系统功能，对肿瘤进行免疫治疗的作用越来越受关注。通过本课题的研究可了解膀胱癌免疫抑制的分子机制，为膀胱癌的预防及治疗提供理论基础。