论文部分内容阅读
目的：根尖周炎（Periapical Periodontitis，AP）的病理特征是根尖周组织的炎性骨吸收。破骨细胞（Osteoclast，OC）是人体唯一具有骨吸收作用的细胞，主要来源于造血干细胞，或由造血干细胞分化而来的单核细胞和巨噬细胞。前期研究表明，破骨细胞分化受到一类单链非编码小分子RNA（microRNA，miRNA）的调控。其主要通过降低mRNA的稳定性或抑制mRNA的蛋白质翻译发挥功能。本研究尝试探究miR-338-3p在破骨细胞分化过程的作用及其具体作用机制。 方法:在本研究中，单核/巨噬细胞系RAW264.7细胞在巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)和核因子κB受体活化素配体(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，RANKL)诱导下向破骨细胞分化，利用实时荧光定量PCR（Quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR）检测miR-338-3p在破骨细胞分化过程中的表达模式。利用脂质体转染(transfection)类似物（mimic）过表达miR-338-3p；转染抑制剂（inhibitor）抑制miR-338-3p表达，转染6h后的RAW264.7细胞加入M-CSF和RANKL诱导3天，qRT-PCR检测miR-338-3p和破骨细胞分化相关基因核因子kB（Nuclear factorκB，NF-κB）、小眼畸形相关转录因子（microphthalmia-associatedtranscription factor，MITF)、活化T细胞细胞质核因子1（nuclear factor of activated T cells cytoplasmic1，NFATc1）表达趋势并进行抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色。生物信息学分析提示V-maf肌键膜纤维肉瘤癌基因同源物B（V-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B，MafB）可能为miR-338-3p的下游靶基因之一，qRT-PCR检测MafB在破骨细胞分化过程中的表达趋势，利用双萤光素酶报告实验（dual luciferase assays,DLA）检测报告基因的萤光素酶活性，过表达和抑制miR-338-3p后通过qRT-PCR和免疫印迹（western blot）检测MafB的表达趋势。过表达载体（pcDNA3.1@MafB）和小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）分别转染RAW264.7细胞，转染后的细胞加入M-CSF和RANKL诱导3天，qRT-PCR和TRAP染色验证靶基因MafB对破骨细胞分化的作用。RAW264.7细胞转染siRNA抑制靶基因MafB后再转染miR-338-3p，M-CSF和RANKL诱导向破骨细胞分化，qRT-PCR和TRAP染色分析miR-338-3p与MafB在破骨细胞分化中的相互作用。 结果:1.在RAW264.7细胞中加入M-CSF和RANKL诱导分化为破骨细胞的过程中，miR-338-3p表达逐渐上调。2.过表达miR-338-3p促进破骨细胞分化，而抑制miR-338-3p抑制破骨细胞分化：miR-338-3p正向调节破骨细胞分化。3.miR-338-3p直接结合到MafB的3’-UTR区域，抑制MafB基因的表达。4.过表达MafB抑制破骨细胞分化，抑制MafB促进破骨细胞分化：MafB负向调节破骨细胞分化。5.siRNA抑制MafB阻断了miR-338-3p对破骨细胞分化的影响，miR-338-3p通过与MafB结合促进破骨细胞分化。 结论:miR-338-3p调控MafB促进破骨细胞分化。