恶性肿瘤目前仍然是一类严重危害人类生命的常见病,随着现代医学的发展,基因治疗作为一种全新的治疗方法受到关注。国外已把基因治疗作为恶性肿瘤常规治疗无效后的一种标准治疗尝试。但由于存在载体转染效率较低、靶向性不足、使用有一定毒副作用、对肿瘤细胞的杀伤效率不够高的问题,因此如何有效地减少载体及前体药物用量和毒性,增强基因治疗系统对肿瘤的杀伤力的解决就显得极为迫切。中药具有毒副作用较少,可减轻放化疗副作用等优势,从中寻找自杀基因增效药物,进行中西医结合治疗肿瘤也愈来愈被世界医学所认可和接受。研究目的:本实验研究姜黄素对自杀基因系统的协同增效作用及作用机制,探讨其通过GJIC或细胞凋亡机制增强自杀基因旁观者效应的药理靶点,阐明其增效的机理,为建立肿瘤基因治疗联合中医药疗法,推进肿瘤基因治疗的临床应用和抗肿瘤中药新药开发提供实验依据。实验方法:1.采用MTT法从姜黄素中筛选对肿瘤自杀基因旁观者效应有协同作用的作用浓度（用金正均Q值作为评价标准）。首先检测姜黄素对大鼠肝癌细胞CBRH7919和小鼠黑色素瘤细胞B16的作用:分别用终浓度为0μM、3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM的姜黄素作用CBRH7919细胞48h和终浓度为0μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM的姜黄素作用B16细胞72h。倒置显微镜下观察药物作用前后各组细胞的数目和形态;MTT法检测各组细胞存活率。接着筛选GCV对B16细胞的最佳工作浓度和HSV-tk/GCV治疗中tk⁺:tk^-细胞的最佳比例:选择GCV浓度为0μM、3.925μM、7.85μM、15.7μM、31.4μM、62.8μM作用B16细胞72h;选择tk⁺:tk^-细胞比例为0%、10%、20%、30%、50%、100%的B16细胞作用48h。倒置显微镜下观察药物作用前后各组细胞的数目和形态;MTT法检测各组细胞存活率。最后检测姜黄素对CBRH7919和B16细胞HSV-tk/GCV系统旁观者效应的影响:用终浓度为6.25μM、12.5μM、25μM的姜黄素与终浓度为15.7μM的GCV分别和联合作用10%CBRH7919/tk⁺细胞和20%B16/tk⁺细胞48h。倒置显微镜下观察药物作用前后各组细胞的数目和形态;MTT法检测各组细胞抑制率,两两比较分析各组细胞抑制率的差异和旁观者效应大小,并用金正均Q值分析姜黄素与HSV-tk/GCV系统联合的相互作用是否具有协同性。2.采用流式细胞技术检测姜黄素对肝癌细胞周期及细胞凋亡指数的影响。PI单染法检测姜黄素对10%CBRH7919/tk⁺细胞周期的影响:用终浓度为6.25μM、12.5μM、25μM的姜黄素与终浓度为15.7μM的GCV分别和联合作用10%CBRH7919/tk⁺细胞48h。流式细胞技术分析各组细胞周期相。AnnexinV/PI双染色法检测姜黄素对细胞凋亡指数的影响:用终浓度为6.25μM、12.5μM、25μM的姜黄素与终浓度为15.7μM的GCV分别和联合作用10%CBRH7919/tk⁺细胞48h。流式细胞技术分析各组细胞凋亡指数。计算各组细胞抑制率,两两比较分析各组细胞抑制率的差异和旁观者效应大小,并用金正均Q值分析姜黄素与HSV-tk/GCV系统联合的相互作用是否具有协同性。3.采用预标记双染料传输技术观察姜黄素对CBRH7919及B16的GJIC功能的影响。分别用终浓度为6.25μM、12.5μM、25μM的姜黄素作用CBRH7919和B16细胞48h,然后采用预标记双染料传输技术及流式细胞术检测各组细胞GJIC功能。4.采用RT-PCR及Western-blot技术检测姜黄素对缝隙连接Cx26和Cx43的影响。分别用终浓度为6.25μM、12.5μM、25μM的姜黄素作用CBRH7919细胞和B16细胞48h,然后采用RT-PCR和Western-blot技术检测各组细胞Cx26和Cx43的的表达量。实验结果:1.姜黄素对HSV-tk/GCV系统旁观者效应的影响首先姜黄素对CBRH7919和B16细胞的杀伤作用:镜下观察可见,对照组细胞生长状况良好,贴壁很稳,密度高,细胞呈梭状、菱形、三角形或多边形;与对照组细胞相比,加药组均出现细胞数目减少、贴壁的细胞少、细胞碎片和细胞死亡（细胞变圆、脱落）。姜黄素作用CBRH7919细胞48h各浓度组细胞存活率分别为:96.0±2.45%、96.01±3.05%、92.69±2.32%、52.54±3.35%、33.62±5.44%;姜黄素作用B16细胞72h各浓度组细胞存活率分别为:71.35±1.35%、62.40±0.30%、36.0±7.0%、10.0±0.20%。实验证明:选择发挥最大药效且对B16细胞毒性最小的15.7μMGCV作为最佳工作浓度;在20%B16/tk⁺混合比例下药物可作用空间比较大,有利于观察药物对旁观者效应的诱导促进作用。姜黄素对自杀基因旁观者效应的体外MTT法筛选结果显示:用6.25μM、12.5μM和25μM的姜黄素联合CBRH7919细胞10%tk⁺/GCV组的细胞抑制率（%）分别为23.12±8.49、32.34±4.07、35.48±2.53,与单纯10%tk⁺/GCV组（10.80±5.03）和相应的各浓度单纯姜黄素组（0.00±5.27、5.90±8.54、22.47±2.37）的抑制率相比都高。各组细胞实际抑制率和理论抑制率的两两比较及金正均Q值计算结果显示:6.25μM、12.5μM和25μM的姜黄素联合10%tk⁺/GCV组的实际抑制率（分别为23.12%、32.34%、35.48%）显著高于理论抑制率（分别为10.80%、16.07%、30.84%）,金正均Q值分别为2.14、2.01、1.15均≥1.15,说明其增效作用为协同作用;用6.25μM、12.5μM和25μM的姜黄素联合B16细胞20%tk⁺/GCV组的细胞抑制率分别为32.15±0.81%、39.92±0.48%、67.98±0.67%,与单纯20%tk⁺/GCV组（13.96±1.93%）和相应的各浓度单纯姜黄素组（6.27±1.15%、22.20±0.96%、51.36±0.93%）的抑制率相比明显要高。各组细胞实际抑制率和理论抑制率的两两比较及金正均Q值计算结果显示:6.25μM、12.5μM和25μM的姜黄素联合20%tk⁺/GCV组的实际抑制率（分别为32.15%、39.92%、67.98%）显著高于理论抑制率（分别为19.36%、33.07%、58.15%）,金正均Q值分别为1.66、1.21、1.17均>1.15,说明其增效作用为协同作用。2.姜黄素对肝癌细胞周期及细胞凋亡指数的影响流式细胞仪检测分析显示:6.25μM、12.5μM和25μM的姜黄素作用于CBRH7919的10%tk⁺细胞48h,G₀/G₁期比例降低,S期、G₂/M期比例增高,呈剂量依赖关系,提示姜黄素可促进其从G₀/G₁期到S期的发展;姜黄素与HSV-tk/GCV系统联合作用48小时,可显著使更多癌细胞停留于S期,并诱导部分细胞凋亡。6.25μM、12.5μM和25μM的姜黄素联合10%tk⁺/GCV组的细胞实际抑制率（分别为14.20%、15.65%、18.05%）和理论抑制率（分别为10.85%、12.10%、13.60%）的两两比较及金正均Q值计算结果显示,金正均Q值分别为1.31、1.29、1.33均≥1.15,说明其增效作用为协同作用;3.姜黄素对CBRH7919及B16的GJIC功能的影响双染料传输技术结合流式细胞仪检测结果显示:姜黄素可增强CBRH7919及B16细胞间缝隙连接通讯功能。4.姜黄素对缝隙连接Cx26和Cx43的影响RT-PCR和Western-blot检测结果显示:姜黄素能提高CBRH7919及B16细胞缝隙连接Cx26和Cx43的mRNA及蛋白表达,并有细胞特异性及转录和翻译等水平上的差异。实验结论:本文在细胞水平实验探讨了中药活性成分姜黄素对HSV-tk/GCV自杀基因系统的增效作用,发现姜黄素能有效增强自杀基因对细胞杀伤力,提高旁观者效应,而且有协同增效作用。对其机制研究分析表明,其作用机制很可能是通过增强细胞的GJIC或诱导凋亡,调节细胞周期等来起作用,也可能是几个机制都起作用。