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p62,别名sequestosome-1,是细胞自噬通路上的一个非常重要的受体蛋白。p62含有的多个功能结构域使之成为细胞多个信号通路的中心环节,能够介导蛋白聚集体、病毒衣壳蛋白、可溶性蛋白、入侵的细菌以及细菌前体通过细胞自噬进行降解。前期研究发现,在细胞中过表达家蚕p62（SilkDB:BGIBMGA002620-PA）后,再感染BmNPVT3株,将导致polyhedrin表达量降低,呈现多角体的细胞数量也显著减少,表明宿主细胞表达的p62可一定程度上限制BmNPV的感染。ref（2）P是家蚕p62的一个旁系同源蛋白,两蛋白有相似的生物学特性。本论文对家蚕p62在大肠杆菌中的表达、p62与polyhedrin之间的结合、ref（2）P形成聚集体（inclusion body,IB）的分子基础进行了初步的研究。主要结果如下所述。1.p62在大肠杆菌细胞中成功表达与p62多克隆抗体的制备在载体pET-30a的基础上,将p62融合在eGFP的C-末端,构建表达融合蛋白eGFP-p62的载体。转化大肠杆菌BL21（DE3）后,使用不同浓度的IPTG进行诱导。SDS-PAGE和考马斯亮蓝分析显示,eGFP-p62高效表达。纯化eGFP-p62,制备了p62的鼠源多克隆抗体。2.家蚕p62、ref（2）P的特性以人类p62（NP003891.1）的氨基酸序列为搜索序列,在NCBI上对家蚕蛋白质数据库进行BLASTP分析。家蚕p62基因（NCBI GeneID:101736823）的蛋白产物有2个:p62（proteinid:XP004932349.1）和ref（2）P（proteinid:XP012551153.1）。从氨基酸序列上看,与p62相比,ref（2）P不含PB1结构域,但两蛋白的其它氨基酸序列（包含ZZ、LIR、UBA等结构域）是完全一致的,表明p62与ref（2）P的分子生物学特性有差异,也有共性。构建p62、ref（2）P的瞬时表达载体,并融合在eGFP或mCherry的C-末端,转染家蚕细胞后,用激光共聚焦显微镜进行观察。实验发现,在BmN细胞中单独表达eGFP-p62、eGFP-ref（2）P时,p62、ref（2）P在细胞质中形成聚集体。这种聚集体被称为IB。当mCherry-p62与eGFP-ref（2）P共表达时,p62与ref（2）P在细胞质中共定位且形成IB。3.p62、ref（2）P形成IB的机理研究构建ref（2）P的两个氨基酸簇（M1、M2）中的多个疏水性氨基酸的多重点突变体,与eGFP融合并转染家蚕细胞,48 h后用激光共聚焦显微镜进行观察。实验发现,突变体eGFP-ref（2）P（M1-A）,eGFP-ref（2）P（M2-A）在细胞质中形成的IB数量明显减少;突变M1、M2内的全部疏水性氨基酸,在绝大多数被转染的BmN细胞中,eGFP-ref（2）P（M1/M2-A）在细胞质中不能形成IB而变得弥散。由于M1、M2区域多为疏水性氨基酸,结合对这两个区域的三维空间结构的分析,我们推测家蚕ref（2）P通过M1、M2区域疏水性氨基酸之间的结合形成IB。构建p62 M1和M2双突变体eGFP-p62（M1/M2-A）,转染BmN细胞,激光共聚焦显微镜仍能观察IB的形成。参考人类p62 IB生成的关键性氨基酸K7和D69,突变家蚕对应的氨基酸K8和D59,构建eGFP-p62（K8/D59/M1/M2-A）的瞬时表达载体。激光共聚焦显微镜观察到绝大部分被转染的BmN细胞中无IB生成且荧光变得弥散。我们得出结论:家蚕p62 IB形成的途径可能有两个,即M1、M2区域的疏水作用,以及K8、D59之间的静电作用。M1区域在人类p62中不存在,结合已经报道的文献,我们认为人类p62与家蚕p62形成IB的机理是不完全相同的。4.polyhedrin与p62/ref（2）P结合区域初探（1）在对ref（2）P结构域分析基础上,构建一系列截短突变体,并与polyhedrin-mCherry共表达。尽管polyhedrin是一个含有核定位信号的蛋白,但当与ref（2）P或p62共表达后,部分polyhedrin-mCherry与eGFP-ref（2）P（或eGFP-p62）共定位且在细胞质中形成IB。构建ref（2）P结构域UBA缺失的突变体,与polyhedrin-mCherry共表达后,激光共聚焦显微镜观察到eGFP-ref（2）P（ΔUBA）主要分布于细胞质,而polyhedrin-mCherry主要定位于细胞核中;两融合蛋白不能共定位,且没有在细胞质内形成IB。当eGFP-ref（2）P（M2-A）与polyhedrin-mCherry共表达后,也得到了类似的实验结果。这些结果表明,ref（2）P通过UBA结构域内的M2氨基酸簇与polyhedrin结合。（2）构建polyhedrin的一系列截短突变体,polyhedrin（1-28）、polyhedrin（1-63）、polyhedrin（1-95）、polyhedrin（1-112）、polyhedrin（1-129）、polyhedrin（1-189）、polyhedrin（1-211）和polyhedrin（1-232）。与eGFP融合后进行瞬时表达,激光共聚焦显微镜观察到polyhedrin（1-28）、polyhedrin（1-63）、polyhedrin（1-95）、polyhedrin（1-112）、polyhedrin（1-129）和polyhedrin（1-232）主要分布于细胞核内,而polyhedrin（1-189）和polyhedrin（1-211）却定位于细胞质中且形成了IB。将这些截短突变体与p62共表达,激光共聚焦显微镜发现这些截短突变体与p62共定位,且在细胞质中形成IB。polyhedrin（1-28）是目前已知可与p62结合的最短肽段。