目的:肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一[1]。深入探讨肝癌发病的分子机制以寻求新的诊断和治疗方法是提高肝癌整体疗效的关键。肿瘤的发生是由多种因素造成的,其中细胞内相关基因,如癌基因、细胞凋亡基因等的表达异常是重要原因之一,能够通过引起细胞的一些生物学特性的改变,导致细胞永生化和癌变。有研究表明肿瘤细胞凋亡抑制因子活性的增强,能抵抗细胞凋亡信号通路的激活,使肿瘤细胞逃避体内免疫系统的识别和清除,最后导致肿瘤的形成[2]。抑制肿瘤细胞内与凋亡抵抗相关基因的表达不仅可诱导肿瘤细胞的凋亡而且还可选择性增加肿瘤细胞对以凋亡为机制的治疗方法的敏感性,从而提高肿瘤患者的总体生存率[3]。因此特异性阻止细胞内凋亡抑制因子的表达已成为肿瘤治疗的新途径。凋亡相关基因Bcl-2 (B cell lymphoma/leukemia 2即B细胞淋巴瘤/白血病基因2)家族[4]是凋亡调控的重要蛋白家族。该基因家族成员在调节细胞存活与凋亡方面起着重要作用,由凋亡诱导成员与凋亡抑制成员组成。凋亡抑制基因Bcl-xL是Boise[5]等在1993年发现的一类与Bcl-2有44%同源且功能相似的蛋白质,可编码233个氨基酸,含有保守的BH1和BH2结构。研究证实,Bcl-xL表达于神经组织和胸腺等正常组织,同时高表达于多种人类的恶性肿瘤,如淋巴瘤[6]、肝癌[7]、肺癌[8]等,与这些肿瘤的发生、发展及耐药、预后等方面有关。RNA干扰[9] (RNA interference,RNAi)技术是近年来发展起来的分子技术,是指内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的细胞内mRNA发生特异性降解,导致靶基因的表达沉默,产生相应的功能表型缺失的现象。具有抑制作用强、稳定性高、细胞易摄取等优点。目前RNAi在基因功能、抗肿瘤和抗病毒基因治疗等方面的研究已取得进展[10-12]。本研究我们利用转录载体Pgenesil-2靶向构建Bcl-xL的siRNA真核表达载体,转染入人肝癌细胞株HepG-2,采用MTT法、RT-PCR、流式细胞术等方法,观察其对HepG-2细胞增殖及凋亡等生物学功能的影响,初步探讨Bcl-xL在肝细胞癌中的生理机制,为开辟Bcl-xL介导RNA干扰治疗肝癌提供实验基础。方法:1. Bcl-xL的siRNA真核表达载体的构建,测序和酶切鉴定证实序列的正确性。2.利用脂质体法将Bcl-xL干扰质粒或通用阴性干扰质粒(HK)转染入人肝癌细胞HepG-2, G418加压筛选,检测细胞克隆中Neo基因的表达,进一步确认阳性克隆。3.克隆扩大培养,应用流式细胞术及RT-PCR方法检测转染后Bcl-xL蛋白水平及mRNA水平的表达变化。4.应用MTT比色法检测转染后细胞的增殖情况;应用Annexin V-FITC和PI双染凋亡诊断法分析各组细胞的凋亡情况;利用流式细胞术检测Bcl-2家族凋亡抑制蛋白Bcl-2及凋亡刺激蛋白Bax表达的相应变化。结果:1.转染阴性对照质粒及Bcl-xL siRNA干扰质粒的细胞中均有Neo基因表达。2.转染Bcl-xL干扰质粒可使HepG-2细胞中Bcl-xL蛋白及mRNA表达均下降,抑制率分别达到53.3%与86.6%。3.转染Bcl-xL干扰质粒使HepG-2细胞生长速度减慢,并随时间的延长而减慢加剧。4.转染Bcl-xL干扰质粒促进了HepG-2细胞的自发性凋亡的发生,早期凋亡及晚期凋亡分别提高了6.75和3.45倍。5.肝癌HepG-2细胞Bcl-2蛋白低表达。转染Bcl-xL干扰质粒后凋亡刺激蛋白Bax的表达上调,而Bcl-2无明显改变。结论:凋亡抑制基因Bcl-xL的siRNA干扰质粒转染入人肝癌细胞株HepG-2,可以使Bcl-xLmRNA转录后降解,进而引起功能性Bcl-xL蛋白表达下调。HepG-2细胞自发性凋亡增加,增殖明显受抑,这种抑制作用可能是通过诱导细胞自发性凋亡来实现的,为开辟Bcl-xL介导的RNA干扰治疗肝癌提供实验基础。