【研究背景及目的】随着全球肥胖人群的不断增多,非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）已成一种常见疾病,其发病呈现出逐年递增的趋势。近年来,多项研究证明,NAFLD患者常与肥胖、高血糖、高血脂、高血压等疾病伴随发生,与2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）、代谢综合征以及心、脑血管疾病密切相关。NAFLD和T2DM的共同发病机制是胰岛素抵抗,两者相互促进,相互恶化,已成为近年来临床治疗的新挑战。肝细胞核因子（hepatocyte nuclear factor,HNFs）是一类在肝脏优势表达的转录因子,目前已发现的HNF成员包括5种,它们分别是HNF1、HNF3、HNF4、HNF6以及CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBP）。HNFs通过准确调控下游多种重要的肝细胞功能基因表达,在肝脏发育和肝细胞分化以及功能维持中起关键作用。其中HNF1α是HNFs家族的主要成员之一,属于POU-同源结构域家族。HNF1α在肝脏中表达水平最高,在肾脏、小肠、胰腺β细胞中也有一定的表达,它对肝脏中许多的重要功能基因进行调控,对肝脏的发育中是不可或缺的。以往针对HNF1α的研究中分为两方面:（1）HNF1α全身敲除小鼠出现高血糖和高脂血症。（2）HNF1α基因失活突变后,异常的HNF1α蛋白抑制肝脏脂肪酸结合蛋白（L-FABP）的功能,使肝细胞脂肪酸转运功能损害,最终导致肝细胞内脂质沉积。以上研究结果提示HNF1α可能是脂肪肝和糖尿病发生发展过程中的抑制因子,但该推论还需进一步证实。基于以上研究背景,本研究首先通过建立NAFL模型小鼠,观察HNF1α在其肝脏中的表达变化,分析相关性;利用Cre-Lox P重组酶系统,首次获得了肝细胞特异性敲除HNF1α小鼠,通过该小鼠研究分析HNF1α在NAFLD形成过程中发挥的作用,探究胰岛素抵抗和血糖升高是否会促进NAFLD患者肝脏出现不良结局,如肝硬化或肝癌等;运用腺相关病毒特异性上调肝细胞中HNF1α表达,观察其是否能改善NAFLD症状;利用以上模型进一步探索其中的机制。【实验方法】一、HNF1α在NAFL模型小鼠肝脏中的表达情况利用高脂饲料建立了非酒精性脂肪肝模型小鼠。利用IPGTT方法检测小鼠末梢血糖情况,通过肝组织病理学染色观察肝脏形态学表现,从而判断造模是否成功。提取肝脏组织RNA,通过Real-time PCR检测肝组织中糖脂代谢基因ACC、FAS、SREBP-1c、GCK、PEPCK和炎症因子TNFα、TGFβ、IL-6的表达量,提取肝脏组织RNA和蛋白,利用Real-time PCR、western blot和免疫组织化学方法,检测肝组织中HNF1α的表达水平。二、特异性调控肝细胞HNF1α对小鼠非酒精性脂肪性肝病发生发展的作用1、Hnf1αH-KO小鼠的建立利用基因打靶技术建立Hnf1af/f小鼠,将Hnf1af/f小鼠与Alb-Cre小鼠杂交,获得的杂合子小鼠之间再次杂交后,可获得Hnf1af/f和Hnf1a^H-KO两种基因型小鼠。通过鼠尾DNA抽提,普通PCR技术扩增目的基因和琼脂糖凝胶电泳技术检测小鼠基因型,并根据结果将Hnf1af/f和Hnf1a^H-KO两种基因型小鼠进行区分并分组。2、各组织和肝细胞中HNF1α表达情况的检测提取Hnf1af/f和Hnf1a^H-KO小鼠肝脏、胰腺、小肠和肾脏组织RNA和蛋白,利用Real-time PCR、western blot和免疫组织化学方法,检测HNF1αm RNA和蛋白的表达水平。分离Hnf1af/f和Hnf1a^H-KO小鼠原代肝细胞和非实质细胞,提取细胞中的蛋白,利用western blot方法检测HNF1α蛋白的表达水平。3、Hnf1a^H-KO小鼠肝脏形态学表现及糖脂代谢基因检测处死10周龄、30周龄Hnf1af/f和Hnf1a^H-KO小鼠,通过肝组织病理学染色观察肝脏形态学表现,并进行病理学评估。收集Hnf1af/f和Hnf1a^H-KO小鼠血清,检测小鼠血清中CHOL、TG、LDL-C3和ALT的表达水平。利用Hnf1af/f和Hnf1a^H-KO小鼠肝组织匀浆检测肝组织中TG表达量。提取Hnf1af/f和Hnf1a^H-KO小鼠肝脏RNA和蛋白,利用Real-time PCR和western blot方法,检测糖脂代谢相关基因ACC、SREBP-1c、FAS、GCK、GCKR和纤维化相关基因Collagen 1、α-SMA的表达水平。4、于NAFL模型小鼠中特异性上调肝细胞HNF1α表达（1）空白对照组（CTR AAV-TBG）的建立:普通饲料喂养C57BL/6小鼠5只,于第10周尾静脉AAV-TBG（2×1011 Vg/只,1次）,于第20周时处死小鼠（2）对照组和实验组的建立（HFD AAV-TBG&HFD AAV-HNF1α）:高脂饲料喂养C57BL/6小鼠建立NAFL模型小鼠,于高质饮食第10周将NAFL模型小鼠随机分为2组,每组各5只,分别通过尾静脉注射AAV-TBG和AAV-HNF1α（2×1011 Vg/只,1次）,于第20周处死各组小鼠5、观察NAFL模型小鼠肝细胞过表达HNF1α后肝脏形态学表现及肝脏糖脂代谢基因的检测取CTR AAV-TBG组、HFD AAV-TBG组和HFD AAV-HNF1α组小鼠肝组织进行病理学染色并观察肝脏形态学变化。提取以上三组小鼠肝组织中RNA和蛋白,利用Real-time PCR和western blot方法,检测糖脂代谢相关基因ACC、SREBP-1c、FAS、GCK、GCKR和纤维化相关基因Collagen 1、α-SMA的表达水平。三、HNF1α抑制非酒精性脂肪性肝病发生发展的机制研究1、利用10周龄、30周龄和70周龄Hnf1a^H-KO小鼠,通过Real-time PCR和免疫组织化学方法,检测肝组织中炎症因子TNFα、TGFβ、IL-6的m RNA和蛋白水平,通过western blot方法检测肝组织STAT3和p65的蛋白水平。2、利用10周龄Hnf1a^H-KO小鼠原代肝细胞,通过Real-time PCR方法检测原代肝细胞中炎症因子TNFα、TGFβ、IL-6的m RNA水平,通过western blot方法检测原代肝细胞中STAT3和p65的蛋白水平。3、利用CTR AAV-TBG组、HFD AAV-TBG组和HFD AAV-HNF1α组小鼠,利用免疫组化方法,检测肝脏内炎症因子TNFα、TGFβ、IL-6的蛋白表达,通过western blot方法检测肝脏内STAT3和p65的蛋白水平。五、统计学分析数据运用SPSS 18.0软件进行相关统计分析,多组间采用One-Way ANOVA分析,配对资料采用配对t检验,方差非齐性则采用非参数检验,实验数据以X±SD表示,P<0.05具有显著差异,P<0.01具有非常显著差异。【实验结果】一、HNF1α在NAFL模型小鼠肝脏中的表达情况（1）NAFL模型小鼠肝脏出现大量脂质沉积,于高脂饮食30wk时小鼠血糖升高,出现肝纤维化;（2）与对照组小鼠相比,NAFL模型小鼠肝脏脂质合成相关基因ACC、FAS和SREBP-1c等m RNA的表达明显升高;（3）与对照组小鼠相比,NAFL模型小鼠糖代谢关键酶GCK m RNA的表达显著降低,糖异生关键限速酶PEPCK m RNA的表达明显升高;（4）与对照组小鼠相比,NAFL模型小鼠炎症因子TNFα、TGFβ和IL-6 m RNA的表达明显升高;（5）与对照组小鼠相比,NAFL模型小鼠HNF1α基因m RNA的表达量在高脂饮食10wk时出现一过性升高后,于高脂饮食30wk时明显下调,western blot和免疫组化进一步确定NAFL模型小鼠肝脏中HNF1α的蛋白水平于高脂饮食30wk时表达显著下降。二、特异性调控肝细胞HNF1α对小鼠非酒精性脂肪性肝病发生发展的作用1、Hnf1a^H-KO小鼠各组织和肝细胞中HNF1α表达的检测（1）与Hnf1af/f小鼠相比,Hnf1a^H-KO小鼠肝脏中HNF1αm RNA和蛋白的表达明显下降;（2）与Hnf1af/f小鼠相比,Hnf1a^H-KO小鼠小肠、肾脏和胰腺中HNF1αm RNA和蛋白水平的表达没有变化;（3）与Hnf1af/f小鼠相比,Hnf1a^H-KO小鼠原代肝细胞中HNF1α蛋白水平的表达明显降低;（4）与Hnf1af/f小鼠相比,Hnf1a^H-KO小鼠非实质细胞中HNF1α蛋白水平的表达没有变化。2、Hnf1αH-KO小鼠血脂、肝功能及血糖情况的检测（1）与Hnf1αf/f小鼠相比,Hnf1αH-KO小鼠于10周龄时出现血清总胆固醇（CHO-C3）明显升高、低密度脂蛋白（LDL-C3）降低;（2）与Hnf1αf/f小鼠相比,Hnf1αH-KO小鼠谷氨酸-丙酮酸转氨酶（ALT）明显升高;（3）与Hnf1αf/f小鼠相比,Hnf1αH-KO小鼠IPGTT检测显示,30周龄Hnf1αH-KO小鼠血糖水平分别于葡萄糖注射后60分钟和90分钟时升高。3、Hnf1a^H-KO小鼠肝脏形态学表现及糖脂代谢基因检测（1）与Hnf1af/f小鼠相比,10周龄Hnf1a^H-KO小鼠出现肝脏脂质沉积,30周龄Hnf1a^H-KO小鼠肝脏脂质沉积加重,炎症细胞浸润,出现肝纤维化,70周龄Hnf1a^H-KO小鼠发生高分化型肝细胞癌;（2）与Hnf1af/f小鼠相比,Hnf1a^H-KO小鼠肝脏脂质合成相关基因ACC、FAS和SREBP-1c m RNA的表达明显升高,Hnf1a^H-KO小鼠肝脏内TG含量明显升高;（3）与Hnf1af/f小鼠相比,Hnf1a^H-KO小鼠糖代谢关键酶GCK的m RNA表达量明显降低,GCK-GCKR比例明显降低;4、NAFL模型小鼠肝细胞过表达HNF1α后肝脏内HNF1α表达的检测（1）与CTR AAV-TBG组小鼠相比,HFD AAV-TBG组小鼠中肝脏内HNF1αm RNA的表达明显下降;（2）与HFD AAV-TBG组小鼠相比,HFD AAV-HNF1α组小鼠肝脏内HNF1α在m RNA和蛋白水平均明显升高,并且高于CTR AAV-TBG组小鼠肝脏内HNF1α的表达水平。5、NAFL模型小鼠肝细胞过表达HNF1α后肝脏形态学表现和糖脂代谢相关基因的检测（1）与HFD AAV-TBG组小鼠相比,HFD AAV-HNF1α组小鼠脂肪肝症状明显改善,肝脏内未出现炎症细胞浸润,未见肝脏内纤维化形成;（2）与HFD AAV-TBG组小鼠相比,HFD AAV-HNF1α组小鼠SREBP-1c、FAS和ACC m RNA的表达水平和肝组织TG含量明显降低;（3）与HFD AAV-TBG组小鼠相比,HFD AAV-HNF1α组小鼠中GCK m RNA的表达明显升高,GCK-GCKR比例明显升高。三、HNF1α抑制非酒精性脂肪性肝病发生发展的机制研究1、Hnf1αH-KO小鼠肝组织中炎症因子和NF-κB、STAT3信号通路的检测（1）与Hnf1af/f小鼠相比,Hnf1a^H-KO小鼠肝组织中TNFα、TGFβ1和IL-6 m RNA和蛋白的表达水平明显升高;（2）与Hnf1af/f小鼠相比,Hnf1a^H-KO小鼠肝组织中STAT3和p65磷酸化水平明显升高。2、Hnf1αH-KO小鼠肝细胞中炎症因子和NF-κB、STAT3信号通路的检测（1）与Hnf1af/f小鼠相比,Hnf1a^H-KO小鼠肝细胞中TNFα、TGFβ1和IL-6 m RNA表达水平明显升高;（2）与Hnf1af/f小鼠相比,Hnf1a^H-KO小鼠肝组织中STAT3和p65磷酸化水平明显升高。3、特异性上调NAFL模型小鼠肝细胞中HNF1α后肝脏内炎症因子和NF-κB、STAT3信号通路的检测（1）与HFD AAV-TBG组小鼠相比,HFD AAV-HNF1α组小鼠肝组织中TNFα、TGFβ1和IL-6的蛋白水平明显降低;（2）与HFD AAV-TBG组小鼠相比,HFD AAV-HNF1α组小鼠肝组织中STAT3和p65的磷酸化水平明显降低。【结论】1、HNF1α在NAFLD小鼠肝组织中表达显著降低,与血糖升高和炎症反应密切相关。2、肝细胞特异性缺失HNF1α后小鼠自发NAFLD,并最终进展为肝细胞癌,提示HNF1α在NAFLD发生发展中起重要作用。3、特异性上调肝细胞HNF1α表达显著改善NAFLD症状,有望成为NAFLD治疗的新靶点。4、HNF1α可通过负向调节STAT3和NF-κB信号通路改善NAFLD的发生发展。